Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Summary

Techniken zur Messung der Aktivität von Schlüsselenzymen des Glykogenstoffwechsels werden vorgestellt, wobei ein einfaches Spektralphotometer verwendet wird, das im sichtbaren Bereich arbeitet.

Abstract

Glykogen wird als Speicherform von Glukose von einer Vielzahl von Organismen synthetisiert, die von Bakterien bis hin zu Tieren reichen. Das Molekül besteht aus linearen Ketten von α1,4-verknüpften Glucoseresten, deren Verzweigungen durch Zugabe von α1,6-Bindungen eingebracht werden. Um zu verstehen, wie die Synthese und der Abbau von Glykogen reguliert werden und wie Glykogen seine charakteristische verzweigte Struktur erreicht, müssen die Enzyme der Glykogenspeicherung untersucht werden. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung dieser Enzymaktivitäten verwenden jedoch typischerweise Reagenzien oder Techniken, die nicht allen Forschern zur Verfügung stehen. Hier diskutieren wir eine Reihe von Verfahren, die technisch einfach, kostengünstig und dennoch in der Lage sind, wertvolle Einblicke in die Steuerung der Glykogenspeicherung zu liefern. Die Techniken erfordern den Zugang zu einem Spektralphotometer, das im Bereich von 330 bis 800 nm arbeitet, und werden unter der Annahme beschrieben, dass die Benutzer Einweg-Kunststoffküvetten verwenden. Die Verfahren sind jedoch leicht skalierbar und können für den Einsatz in einem Mikrotiterplatten-Reader modifiziert werden, was eine hochgradig parallele Analyse ermöglicht.

Introduction

Glykogen ist in der Natur weit verbreitet, wobei die Verbindung in Bakterien, vielen Protisten, Pilzen und Tieren gefunden wird. In Mikroorganismen ist Glykogen wichtig für das Überleben der Zellen, wenn Nährstoffe begrenzt sind, und in höheren Organismen wie Säugetieren dienen Synthese und Abbau von Glykogen dazu, den Blutzuckerspiegel zu puffern ^1,2,3. Die Untersuchung des Glykogenstoffwechsels ist daher für so unterschiedliche Bereiche wie die Mikrobiologie und die Säugetierphysiologie von Bedeutung. Um den Glykogenstoffwechsel zu verstehen, müssen die Schlüsselenzyme der Glykogensynthese (Glykogensynthase und das verzweigte Enzym) und des Glykogenabbaus (Glykogenphosphorylase und Debranching-Enzym) untersucht werden. Die Goldstandard-Assays von Glykogensynthase, Phosphorylase, Verzweigung und Entzweigung von Enzymaktivitäten verwenden radioaktive Isotope. Zum Beispiel wird die Glykogensynthase im Allgemeinen in einem gestoppten radiochemischen Assay gemessen, indem Glukose aus UDP-[14 C]glucose (im Fall von tierischen und Pilzenzymen) oder ADP-[¹⁴C]glucose (im Fall von bakteriellen Enzymen) in Glykogen ^4,5 eingebaut wird. In ähnlicher Weise wird die Glykogenphosphorylase in Richtung der Glykogensynthese gemessen, nachdem Glukose aus [¹⁴C]glucose-1-phosphat in Glykogen⁶ eingebaut wurde. Das verzweigte Enzym wird durch Messung der Fähigkeit dieses Enzyms untersucht, den Einbau von [14 C]glucose aus Glucose-1-phosphat in α1,4-verknüpfte Ketten durch Glykogenphosphorylase⁷ zu stimulieren, und die Entzweigungsenzymaktivität wird bestimmt, indem die Fähigkeit des Enzyms verfolgt wird, [¹⁴C]glucose in Glykogen einzubauen⁸ . Obwohl sie sehr empfindlich sind und ihre Verwendung in Rohzellextrakten mit geringer Enzymaktivität ermöglichen, sind die radioaktiven Substrate teuer und unterliegen den regulatorischen Anforderungen, die mit der Verwendung von Radioisotopen verbunden sind. Diese Barrieren machen die Verwendung bestimmter Assays für viele Arbeiter unerreichbar. Im Laufe vieler Jahre wurde jedoch eine beeindruckende Vielfalt spektrophotometrischer Ansätze zur Messung dieser Enzyme beschrieben. Im Allgemeinen beruhen diese Ansätze letztendlich auf der Messung der Produktion oder des Verbrauchs von NADH / NADPH oder der Erzeugung von Farbkomplexen zwischen Glykogen und Jod. Daher sind sie unkompliziert und können mit einfachen Spektralphotometern durchgeführt werden, die nur mit Wolfram- oder Xenon-Blitzlampen ausgestattet sind.

Spektrophotometrische Assays der Glykogensynthase beruhen auf der Messung des Nukleosiddiphosphats, das vom Zuckernukleotiddonor freigesetzt wird, wenn Glukose zur wachsenden Glykogenkette ^9,10 hinzugefügt wird. Das in Abschnitt 1 des Protokolls beschriebene Verfahren zur Messung der Glykogensynthaseaktivität ist eine Modifikation des von Wayllace et ^al.11 beschriebenen Verfahrens, und das Kopplungsschema ist unten dargestellt:

(Glukose) _n + UPD-Glukose → (Glukose)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + Phosphoenolpyruvat → Pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD⁺

Glykogensynthase fügt Glukose aus UDP-Glucose zu Glykogen hinzu. Das dabei erzeugte UDP wird durch Nukleosiddiphosphatkinase (NDP-Kinase) in eine Reaktion umgewandelt, die ADP erzeugt. Das ADP wiederum dient dann als Substrat für die Pyruvatkinase, die das ADP mit Phosphoenolpyruvat als Phosphatdonor phosphoryliert. Das entstehende Pyruvat wird durch das Enzym Laktatdehydrogenase in einer Reaktion, die NADH verbraucht, in Laktat umgewandelt. Der Assay kann daher kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Abnahme der Absorption bei 340 nm überwacht wird, wenn NADH verbraucht wird. Es ist leicht für die Verwendung mit Enzymen geeignet, die ADP-Glukose als Glukosespender benötigen. Hier sind die Kopplungsschritte einfacher, da das ADP, das durch die Wirkung der Glykogensynthase freigesetzt wird, direkt von der Pyruvatkinase beeinflusst wird.

Es gibt eine Vielzahl von spektrophotometrischen Assays zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität. In der klassischen Version wird das Enzym rückwärts in Richtung der Glykogensynthese getrieben, wie unten gezeigt:

(Glukose) _n + Glucose-1-phosphat → (Glucose)_n+1 + P_i

In zeitlichen Abständen werden Aliquots des Reaktionsgemisches entfernt und die freigesetzte Phosphatmenge mit^12,13 quantifiziert. In unseren Händen war dieser Assay aufgrund des Vorhandenseins von leicht messbarem freiem Phosphat in vielen kommerziellen Zubereitungen von Glucose-1-phosphat, kombiniert mit den hohen Konzentrationen von Glucose-1-phosphat, die für die Phosphorylase-Wirkung erforderlich sind, von begrenztem Nutzen. Vielmehr haben wir routinemäßig einen alternativen Assay verwendet, der das Glucose-1-phosphat misst, das freigesetzt wird, wenn Glykogen durch Phosphorylase¹³ abgebaut wird. Es wird ein gekoppeltes Reaktionsschema verwendet, das unten dargestellt ist.

(Glukose) n + P_i → (Glucose)_n-1 + Glucose-1-phosphat

Glucose-1-phosphat → Glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H⁺

Das Glucose-1-phosphat wird durch Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt, und das Glucose-6-phosphat wird dann zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert, mit der gleichzeitigen Reduktion von NADP⁺ zu NADPH. Das in Abschnitt 2 des Protokolls beschriebene Verfahren leitet sich von den von Mendicino et al.14 und Schreiber & Bowling ¹⁵ beschriebenen Methoden ab. Der Assay kann problemlos kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Absorption bei 340 nm im Laufe der Zeit zunimmt, was die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit ermöglicht.

Die spektrophotometrische Bestimmung der Debranching-Enzymaktivität beruht auf der Messung der Glukose, die durch die Wirkung des Enzyms auf Phosphorylase-Grenzdextrin¹⁶ freigesetzt wird. Diese Verbindung wird durch erschöpfende Behandlung von Glykogen mit Glykogenphosphorylase hergestellt. Da die Glykogenphosphorylase-Wirkung 4 Glucosereste von einem α1,6-Zweigpunkt entfernt stoppt, enthält das Grenzdextrin Glykogen, dessen äußere Ketten auf ~4 Glucosereste verkürzt wurden. Die Herstellung von Phosphorylase-Grenzdextrin wird hier unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben, das von den von Taylor et al.17 und Makino & Omichi ¹⁸ entwickelten Verfahren abgeleitet ist.

Die Entzweigung ist ein zweistufiger Prozess. Die 4-α-Glucanotransferase-Aktivität des bifunktionellen Entzweigungsenzyms überträgt zunächst drei Glucosereste vom Zweigpunkt zum nicht-reduzierenden Ende einer nahe gelegenen α1,4-verknüpften Glucosekette. Der einzelne, α1,6-verknüpfte Glucoserest, der am Zweigpunkt verbleibt, wird dann durch die α1,6-Glucosidase-Aktivität¹⁹ hydrolysiert. Der Assay wird typischerweise in einer gestoppten Weise durchgeführt, wobei die nach einer bestimmten Zeit (oder einer Reihe von Malen) freigesetzte Glukose in einem gekoppelten Enzymassay gemessen wird, wie unten gezeigt:

(Glukose) n → (Glukose)_n-1 + Glukose

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat + ADP

Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H⁺

Die Bestimmung der produzierten NADPH gibt ein Maß für die Glukoseproduktion. Das in Abschnitt 3 des Protokolls beschriebene Verfahren basiert auf einem von Nelson et ^al.16 beschriebenen Verfahren. Wie die anderen Methoden, die auf dem Verbrauch oder der Erzeugung von NADH / NADPH beruhen, ist der Assay sehr empfindlich. Das Vorhandensein von Amylasen oder anderen Glucosidasen, die auch freie Glukose aus Phosphorylase-Grenzdextrin freisetzen können, führt jedoch zu erheblichen Störungen (siehe Diskussion).

Die kolorimetrische Bestimmung der verzweigten Enzymaktivität beruht auf der Tatsache, dass α1,4-verknüpfte Glukoseketten helikale Strukturen annehmen, die an Jod binden und farbige Komplexe bilden²⁰. Die Farbe des gebildeten Komplexes hängt von der Länge der α1,4-verknüpften Ketten ab. So bildet Amylose, die aus langen, weitgehend unverzweigten Ketten von α1,4-verknüpfter Glucose besteht, mit Jod einen tiefblauen Komplex. Im Gegensatz dazu bilden Glykogene, deren äußere Ketten in der Regel nur 6 bis 8 Glukosereste lang sind, orangerote Komplexe. Wenn eine Lösung von Amylose mit verzweigtem Enzym inkubiert wird, führt die Einführung von Zweigen in die Amylose zur Bildung kürzerer α1,4-verknüpfter Glucoseketten. Somit verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Amylose/Jod-Komplexe in Richtung kürzerer Wellenlängen. Das hier diskutierte Verfahren leitet sich von dem von Boyer & Preiss²¹ beschriebenen ab, und die Verzweigungsenzymaktivität wird als Verringerung der Absorption des Amylose/Iod-Komplexes bei 660 nm im Laufe der Zeit quantifiziert.

Wie aus der obigen Diskussion leicht ersichtlich sein sollte, bedeutet die Tatsache, dass die Farben der zwischen Jod und α1,4-Glucoseketten gebildeten Komplexe mit der Kettenlänge variieren, dass die Absorptionsspektren von Glykogen/Jod-Komplexen mit dem Grad der Glykogenverzweigung variieren sollten. Dies ist in der Tat der Fall, und weniger verzweigte Glykogene / Glykogene mit längeren äußeren Ketten absorbieren Licht bei einer längeren Wellenlänge als Glykogene, die stärker verzweigt sind / kürzere äußere Ketten haben. Die Jodfärbungsreaktion kann daher genutzt werden, um schnelle, qualitative Daten über den Grad der Glykogenverzweigung zu gewinnen²². Die orange-braune Farbe bildet sich, wenn Glykogenkomplexe mit Jod nicht besonders intensiv sind. Die Farbentwicklung kann jedoch durch die Aufnahme von gesättigter Calciumchloridlösung²² verbessert werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode um das 10-fache und ermöglicht eine fertige Analyse von Mikrogrammmengen an Glykogen. Der in Abschnitt 4 des Protokolls beschriebene Assay zur Bestimmung der Verzweigung basiert auf einem von Krisman²² entwickelten Verfahren. Es wird einfach durchgeführt, indem die Glykogenprobe mit Jodlösung und Calciumchlorid in einer Küvette kombiniert und das Absorptionsspektrum von 330 nm bis 800 nm gesammelt wird. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich in Richtung längerer Wellenlängen, wenn der Verzweigungsgrad abnimmt.

Insgesamt bieten die hier beschriebenen Methoden einfache, zuverlässige Mittel, um die Aktivitäten der Schlüsselenzyme des Glykogenstoffwechsels zu bewerten und qualitative Daten über das Ausmaß der Glykogenverzweigung zu erhalten.

Protocol

1. Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität Bereiten Sie die Stammlösungen der erforderlichen Reagenzien gemäß Tabelle 1 (vor dem Versuchstag) vor. Bestandteil Wegbeschreibungen 50 mM Tris pH 8,0 Lösen Sie 0,61 g Tris-Base in ~ 80 ml Wasser auf.  Auf 4 °C abkühlen.   Stel…

Representative Results

Bestimmung der Glykogensynthase-AktivitätAbbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Glykogensynthase-Assays unter Verwendung gereinigter Enzyme. In Panel A kam es nach einer leichten Verzögerung zu einer linearen Abnahme der Absorption bei 340 nm über einen Zeitraum von etwa 12 min. Die Änderungsrate der Absorption in Abbildung 1A betrug ~0,12 Absorptionseinheiten/min. Eine Änderungsrate der Absorption zwischen ~0,010 und ~0,20 Ab…

Discussion

Im Allgemeinen sind die Hauptvorteile aller vorgestellten Methoden ihre niedrigen Kosten, Einfachheit, Geschwindigkeit und fehlende Abhängigkeit von Spezialgeräten. Der größte Nachteil, den sie alle teilen, ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden. Die Sensitivität der Verfahren, die die Produktion oder den Verbrauch von NADH / NADPH beinhalten, ist leicht abzuschätzen. Da der Extinktionskoeffizient von NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 beträgt, zeigt einfache Arithmetik, dass ~^10-20…

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625