Metodi spettrofotometrici per lo studio del metabolismo del glicogeno eucariotico

Summary

Vengono presentate le tecniche per misurare l’attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno, utilizzando un semplice spettrofotometro operante nell’intervallo visibile.

Abstract

Il glicogeno è sintetizzato come una forma di stoccaggio del glucosio da una vasta gamma di organismi, che vanno dai batteri agli animali. La molecola comprende catene lineari di residui di glucosio legati all’α1,4 con rami introdotti attraverso l’aggiunta di legami α1,6. Comprendere come la sintesi e la degradazione del glicogeno sono regolate e come il glicogeno raggiunge la sua caratteristica struttura ramificata richiede lo studio degli enzimi di stoccaggio del glicogeno. Tuttavia, i metodi più comunemente usati per studiare queste attività enzimatiche impiegano tipicamente reagenti o tecniche che non sono disponibili per tutti i ricercatori. Qui, discutiamo una batteria di procedure che sono tecnicamente semplici, economiche e tuttavia in grado di fornire preziose informazioni sul controllo dello stoccaggio del glicogeno. Le tecniche richiedono l’accesso a uno spettrofotometro, operante nell’intervallo da 330 a 800 nm, e sono descritte supponendo che gli utenti utilizzeranno cuvette di plastica usa e getta. Tuttavia, le procedure sono facilmente scalabili e possono essere modificate per l’uso in un lettore di micropiastre, consentendo analisi altamente parallele.

Introduction

Il glicogeno è ampiamente distribuito in natura, con il composto che si trova in batteri, molti protisti, funghi e animali. Nei microrganismi, il glicogeno è importante per la sopravvivenza cellulare quando i nutrienti sono limitanti e, negli organismi superiori come i mammiferi, la sintesi e la degradazione del glicogeno servono a tamponare i livelli di glucosio nel sangue ^1,2,3. Lo studio del metabolismo del glicogeno è, quindi, importante per campi così diversi come la microbiologia e la fisiologia dei mammiferi. Comprendere il metabolismo del glicogeno richiede lo studio degli enzimi chiave della sintesi del glicogeno (glicogeno sintasi e dell’enzima ramificato) e della degradazione del glicogeno (glicogeno fosforilasi ed enzima deramificante). I saggi gold standard della glicogeno sintasi, della fosforilasi, della ramificazione e delle attività enzimatiche di deramificazione impiegano isotopi radioattivi. Ad esempio, la glicogeno sintasi viene generalmente misurata in un saggio radiochimico interrotto seguendo l’incorporazione di glucosio da UDP-[14 C]glucosio (nel caso di enzimi animali e fungini) o ADP-[¹⁴C]glucosio (nel caso di enzimi batterici) nel glicogeno ^4,5. Analogamente, la glicogeno fosforilasi viene misurata nella direzione della sintesi del glicogeno, in seguito all’incorporazione del glucosio dal [¹⁴C]glucosio-1-fosfato nel glicogeno⁶. L’enzima ramificante viene analizzato misurando la capacità di questo enzima di stimolare l’incorporazione di [14 C]glucosio dal glucosio-1-fosfato in catene legate all’α1,4 mediante glicogeno fosforilasi⁷, e l’attività dell’enzima deramificante è determinata seguendo la capacità dell’enzima di incorporare [¹⁴C]glucosio nel glicogeno⁸ . Sebbene molto sensibili, consentendo il loro uso in estratti cellulari grezzi con bassi livelli di attività enzimatica, i substrati radioattivi sono costosi e soggetti ai requisiti normativi relativi all’uso di radioisotopi. Queste barriere pongono l’uso di determinati saggi fuori dalla portata di molti lavoratori. Tuttavia, nel corso di molti anni, è stata descritta un’impressionante varietà di approcci spettrofotometrici alla misurazione di questi enzimi. In generale, questi approcci si basano in ultima analisi sulla misurazione della produzione o del consumo di NADH / NADPH o sulla generazione di complessi colorati tra glicogeno e iodio. Pertanto, sono semplici e possono essere eseguiti utilizzando semplici spettrofotometri dotati solo di lampade flash al tungsteno o allo xeno.

I saggi spettrofotometrici della glicogeno sintasi si basano sulla misurazione del difosfato nucleosidico rilasciato dal donatore di nucleotidi di zucchero quando il glucosio viene aggiunto alla catena di glicogeno in crescita ^9,10. La procedura per misurare l’attività della glicogeno sintasi descritta nella sezione 1 del protocollo, di seguito, è una modifica di quella delineata da Wayllace et ^al.11, e lo schema di accoppiamento è mostrato di seguito:

(Glucosio) _n + UPD-glucosio → (glucosio)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

piruvato + NADH + H + → lattato + NAD ⁺

La glicogeno sintasi aggiunge glucosio da UDP-glucosio al glicogeno. L’UDP generato in questo processo viene convertito in UTP dalla nucleoside difosfato chinasi (NDP chinasi), in una reazione che genera ADP. L’ADP, a sua volta, funge quindi da substrato per la piruvato chinasi, che fosforila l’ADP usando il fosfoenolpiruvato come donatore di fosfato. Il piruvato risultante viene convertito in lattato dall’enzima lattato deidrogenasi in una reazione che consuma NADH. Il test può, quindi, essere eseguito in modo continuo, monitorando la diminuzione dell’assorbanza a 340 nm man mano che il NADH viene consumato. È facilmente adattato per l’uso con enzimi che richiedono ADP-glucosio come donatore di glucosio. Qui, le fasi di accoppiamento sono più semplici poiché l’ADP rilasciato dall’azione della glicogeno sintasi è direttamente agito dalla piruvato chinasi.

Sono disponibili diversi saggi spettrofotometrici per la determinazione dell’attività della glicogeno fosforilasi. Nella versione classica, l’enzima viene spinto all’indietro, nella direzione della sintesi del glicogeno, come mostrato di seguito:

(Glucosio) _n + Glucosio-1-fosfato → (Glucosio)_n+1 + P_i

Ad intervalli di tempo, vengono rimosse le aliquote della miscela di reazione e la quantità di fosfato liberata viene quantificata^12,13. Nelle nostre mani, questo test è stato di uso limitato a causa della presenza di fosfato libero facilmente misurabile in molti preparati commerciali di glucosio-1-fosfato, combinato con le alte concentrazioni di glucosio-1-fosfato necessarie per l’azione della fosforilasi. Piuttosto, abbiamo regolarmente impiegato un test alternativo che misura il glucosio-1-fosfato rilasciato quando il glicogeno viene degradato dalla fosforilasi¹³. Viene utilizzato uno schema di reazione accoppiata, illustrato di seguito.

(Glucosio) n + P_i → (Glucosio)_n-1 + _{Glucosio-1-fosfato}

Glucosio-1-fosfato → Glucosio-6-fosfato

Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H ⁺

Il glucosio-1-fosfato viene convertito in glucosio-6-fosfato dalla fosfoglucomutasi, e il glucosio-6-fosfato viene quindi ossidato a 6-fosfogluconolattone, con la concomitante riduzione di NADP⁺ a NADPH. La procedura descritta nella sezione 2 del protocollo, di seguito, deriva dai metodi descritti da Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling ¹⁵. Il saggio può essere facilmente eseguito in modo continuo, con l’aumento dell’assorbanza a 340 nm nel tempo, consentendo la determinazione della velocità di reazione.

La determinazione spettrofotometrica dell’attività enzimatica deramificante si basa sulla misurazione del glucosio rilasciato dall’azione dell’enzima sulla fosforilasi limite^{di destrina 16}. Questo composto è fatto trattando il glicogeno in modo esaustivo con glicogeno fosforilasi. Poiché l’azione della glicogeno fosforilasi blocca 4 residui di glucosio da un punto di diramazione α1,6, la destrina limite contiene glicogeno, le cui catene esterne sono state ridotte a ~ 4 residui di glucosio. La preparazione della destrina limite della fosforilasi è descritta qui, utilizzando una procedura derivata da quelle sviluppate da Taylor et al.17 e Makino & Omichi ¹⁸.

La deramificazione è un processo in due fasi. L’attività della 4-α-glucanotransferasi dell’enzima deramificante bifunzionale trasferisce prima tre residui di glucosio dal punto di ramificazione all’estremità non riducente di una vicina catena di glucosio legata all’α1,4. Il singolo residuo di glucosio legato all’α1,6 che rimane nel punto di diramazione viene quindi idrolizzato dall’attività dell’α1,6-glucosidasi¹⁹. Il test viene tipicamente eseguito in modo interrotto, il glucosio rilasciato dopo un dato tempo (o serie di volte) viene misurato in un saggio enzimatico accoppiato come mostrato di seguito:

(Glucosio) n → (Glucosio)_n-1 + Glucosio

Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP

Glucosio-6-fosfato + NADP + → 6-fosfogluconolattone + NADPH + H ⁺

La determinazione del NADPH prodotto fornisce una misura della produzione di glucosio. La procedura descritta nella sezione 3 del protocollo, di seguito, si basa su quella descritta da Nelson et ^al.16. Come gli altri metodi che si basano sul consumo o sulla generazione di NADH / NADPH, il test è abbastanza sensibile. Tuttavia, la presenza di amilasi o altre glucosidasi, che possono anche liberare glucosio libero dalla destrina limite della fosforilasi, causerà interferenze significative (vedi Discussione).

La determinazione colorimetrica dell’attività enzimatica ramificata si basa sul fatto che le catene α1,4-legate di glucosio adottano strutture elicoidali che si legano allo iodio, formando complessi colorati²⁰. Il colore del complesso formato dipende dalla lunghezza delle catene α1,4-legate. Pertanto, l’amilosio, che consiste in lunghe catene in gran parte non ramificate di glucosio legato all’α1,4, forma un complesso blu profondo con iodio. Al contrario, i glicogeni, le cui catene esterne sono generalmente nell’ordine di soli 6-8 residui di glucosio, formano complessi rosso-arancio. Se una soluzione di amilosio viene incubata con enzima ramificato, l’introduzione di rami nell’amilosio provoca la generazione di catene di glucosio più corte legate all’α1,4. Pertanto, il massimo assorbimento dei complessi amilosio/iodio si sposta verso lunghezze d’onda più corte. La procedura qui discussa è derivata da quella dettagliata da Boyer & Preiss²¹ e l’attività enzimatica ramificata è quantificata come una riduzione dell’assorbimento del complesso amilosio/iodio a 660 nm nel tempo.

Come dovrebbe essere facilmente evidente dalla discussione precedente, il fatto che i colori dei complessi formati tra le catene di iodio e α1,4-glucosio varino con la lunghezza della catena significa che gli spettri di assorbanza dei complessi glicogeno/iodio dovrebbero variare con il grado di ramificazione del glicogeno. Questo è effettivamente il caso, e glicogeni / glicogeni meno ramificati con catene esterne più lunghe assorbono la luce a una lunghezza d’onda più lunga rispetto ai glicogeni che sono più ramificati / hanno catene esterne più corte. La reazione di colorazione dello iodio può quindi essere utilizzata per ottenere dati rapidi e qualitativi sul grado di ramificazione del glicogeno²². Il colore arancione-marrone si forma quando i complessi di glicogeno con iodio non sono particolarmente intensi. Tuttavia, lo sviluppo del colore può essere migliorato dall’inclusione della soluzione satura di cloruro di calcio²². Ciò aumenta la sensibilità del metodo di circa 10 volte e consente un’analisi pronta delle quantità di microgrammi di glicogeno. Il saggio per la determinazione della ramificazione descritto nella sezione 4 del protocollo, di seguito, è adattato da una procedura sviluppata da Krisman²². Viene condotto semplicemente combinando il campione di glicogeno con soluzione di iodio e cloruro di calcio in una cuvetta e raccogliendo lo spettro di assorbimento da 330 nm a 800 nm. Il massimo di assorbanza si sposta verso lunghezze d’onda più lunghe man mano che il grado di ramificazione diminuisce.

Collettivamente, i metodi qui descritti forniscono mezzi semplici e affidabili per valutare le attività degli enzimi chiave del metabolismo del glicogeno e per ottenere dati qualitativi sull’entità della ramificazione del glicogeno.

Protocol

1. Determinazione dell’attività della glicogeno sintasi Preparare le soluzioni madre dei reagenti necessari come indicato nella Tabella 1 (prima della giornata sperimentale). Componente Indicazioni 50 mM Tris pH 8,0 Sciogliere 0,61 g di Tris base in ~ 80 mL di acqua.  Raffreddare…

Representative Results

Determinazione dell’attività della glicogeno sintasiLa figura 1 mostra risultati rappresentativi dei saggi della glicogeno sintasi utilizzando enzimi purificati. Nel pannello A, a seguito di un leggero ritardo, si è verificata una diminuzione lineare dell’assorbimento a 340 nm nel tempo per un periodo di circa 12 minuti. Il tasso di variazione dell’assorbimento nella Figura 1A era ~0,12 unità di assorbanza/min. Un tasso di variazione dell…

Discussion

In generale, i principali vantaggi di tutti i metodi presentati sono il loro basso costo, la facilità, la velocità e la mancanza di dipendenza da attrezzature specializzate. Il principale svantaggio che tutti condividono è la sensibilità rispetto ad altri metodi disponibili. La sensibilità delle procedure che comportano la produzione o il consumo di NADH / NADPH è facile da stimare. Dato che il coefficiente di estinzione di NADH / NADPH è 6,22 M-1 cm-1, l’aritmetica semplice indica che ~ ^10-20 μM i cam…

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625