Viene segnalato l’uso di idrogel fotodegradabili per isolare le cellule batteriche utilizzando uno strumento di battito luminoso ad alta risoluzione. Vengono esaminate le procedure sperimentali essenziali, i risultati e i vantaggi del processo. Il metodo consente l’isolamento rapido ed economico di batteri mirati che mostrano funzioni rare o uniche da comunità o popolazioni eterogenee.
I biologi hanno a lungo tentato di comprendere la relazione tra fenotipo e genotipo. Per comprendere meglio questa connessione, è fondamentale sviluppare tecnologie pratiche che abbinino lo screening cellulare microscopico con l’isolamento cellulare ad alta purezza per l’analisi genetica a valle. Qui, viene descritto l’uso di idrogel poli(glicole etilenico) fotodegradabili per lo screening e l’isolamento di batteri con fenotipi di crescita unici da popolazioni cellulari eterogenee. Il metodo si basa sull’incapsulamento o sull’intrappolamento delle cellule con l’idrogel, seguito da coltura, screening microscopico, quindi utilizzo di uno strumento di modellazione della luce ad alta risoluzione per il controllo spaziotemporale della degradazione dell’idrogel e il rilascio di cellule selezionate in una soluzione per il recupero. L’applicazione di diversi modelli di luce consente il controllo sulla morfologia della cellula estratta e modelli come anelli o croci possono essere utilizzati per recuperare le cellule con un’esposizione diretta minima alla luce UV per mitigare il danno al DNA agli isolati. Inoltre, lo strumento di modellazione della luce fornisce una dose di luce regolabile per ottenere varie velocità di degradazione e rilascio cellulare. Consente la degradazione ad alta risoluzione, consentendo il recupero delle cellule con precisione spaziale su scala micron. Qui, viene dimostrato l’uso di questo materiale per schermare e recuperare batteri sia da idrogel sfusi che da dispositivi microfabbricati lab-on-a-chip. Il metodo è economico, semplice e può essere utilizzato per applicazioni comuni ed emergenti in microbiologia, tra cui l’isolamento di ceppi batterici con profili di crescita rari da librerie mutanti e l’isolamento di consorzi batterici con fenotipi emergenti per caratterizzazioni genomiche.
L’isolamento di cellule con comportamenti unici da un ambiente complesso ed eterogeneo è fondamentale per ottenere informazioni genetiche in biologia1. In microbiologia, la selezione e l’isolamento di microbi rari o unici dopo l’osservazione diventa importante in molte applicazioni che richiedono una connessione tra informazioni genomiche e informazioni fenotipiche osservabili. Queste applicazioni includono la selezione di ceppi fenotipicamente rari da librerie mutanti2, la selezione di microrganismi chiave da comunità microbiche complesse3,4e la selezione di batteri fenotipicamente rari ma importanti da popolazioni isogeniche. L’isolamento di cellule vitali ma non coltivabili (VBNC) da una popolazione batterica è un esempio importante di quest’ultima, dove le cellule con il fenotipo VBNC sono spesso nascoste in popolazioni di batteri a 1:102 a 1:105 rapporti5,6. A causa delle diffuse difficoltà nell’isolamento dei batteri, molto rimane sconosciuto su molti microrganismi fenotipicamente rari. Queste limitazioni sottolineano la necessità di tecniche di isolamento cellulare per identificare prima la cellula o le cellule bersaglio da una miscela e quindi recuperarle e isolarle per l’analisi molecolare a valle7.
Alcuni dei metodi più comunemente stabiliti di isolamento cellulare includono la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato fluorescente (FACS)8,la separazione immunomagnetica9,10e la microfluidica11. Mentre questi metodi di isolamento hanno un valore elevato, hanno anche degli svantaggi che ne limitano l’uso. Ad esempio, FACS può fornire l’isolamento microbico di routine a livello di singola cellula per l’analisi genomica di follow-up3, ma è spesso limitato dalla sua disponibilità e spesa, nonché dai problemi di contaminazione a valle11. Approcci basati su microfluidici come la citometria a flusso microfluidica hanno ottenuto molta attenzione, che, rispetto alla citometria a flusso convenzionale, consente una significativa riduzione del volume del campione richiesto12. Tuttavia, la separazione e il recupero di un singolo o di piccole raccolte di cellule da dispositivi microfluidici è spesso un problema impegnativo che in genere richiede una configurazione e una progettazione del dispositivo più complesse13. Molti approcci basati su microfluidici caratterizzano geneticamente le cellule prima che vengano immesse e osservate in un dispositivo14, limitando il numero di specie uniche osservate durante l’esecuzione di uno schermo funzionale. Date queste limitazioni, è necessaria un’ulteriore innovazione di metodi e materiali pratici per lo screening e l’isolamento cellulare per un uso diffuso in molti laboratori.
Questo documento presenta un nuovo approccio basato sui materiali per lo screening e l’isolamento dei batteri. Il metodo utilizza idrogel fotodegradabili per l’incapsulamento cellulare, la coltura, l’osservazione microscopica e il rilascio e il recupero su richiesta di batteri mirati con fenotipi unici. Gli idrogel sono progettati per contenere una dimensione di maglia di 10 nm, dove ogni reticolazione contiene gruppi di o-nitrobenzile15. Il materiale incapsula o intrappola le cellule per l’osservazione, consentendo al contempo la diffusione di nutrienti e prodotti di scarto da e verso le cellule per la coltura. L’esposizione del materiale a una sorgente di luce UV a 365 nm modellata attraverso un microscopio verticale consente la degradazione locale dell’idrogel attraverso la fotoccolatura dei gruppi o-nitrobenzile16,17. La degradazione innesca il rilascio selettivo di cellule per il recupero per l’analisi a valle, compresa l’analisi genomica e, potenzialmente, proteomica e trascrittomica. La configurazione sperimentale e il protocollo sono relativamente semplici, economici e traslazionali per i laboratori di microbiologia. Richiede solo l’incapsulamento cellulare attraverso la formazione di idrogel, l’osservazione delle cellule catturate con un microscopio a campo luminoso e fluorescenza verticale e l’illuminazione delle cellule di interesse con una sorgente di luce UV modellata per il recupero.
Un vantaggio chiave di questo approccio allo screening basato sui materiali è la sua adattabilità a diversi formati di screening. Nel suo formato più elementare, il materiale può essere utilizzato per lo screening incapsulando una raccolta di cellule eterogenee in idrogel sfusi. Le cellule vengono quindi osservate per il fenotipo desiderato e le singole cellule di interesse vengono rimosse per la caratterizzazione genomica. In formati più elaborati, il materiale può anche essere integrato in dispositivi lab-on-a-chip per fornire un rilascio e un recupero precisi delle celle dalle aree desiderate del dispositivo. Entrambi i formati sono descritti qui, ed entrambi hanno permesso recenti nuove applicazioni di screening microbico e selezione17,18,19. Il metodo è qui dimostrato con organismi Gram-negativi modello (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) e un organismo modello Gram-positivo (Bacillus subtilis) ed è stato prontamente esteso a una varietà di altri batteri.
Questo manoscritto dimostra l’uso di idrogel fotodegradabili per lo screening e l’isolamento dei batteri. Il materiale e l’approccio consentono una coltura ad alta produttività, il controllo sui terreni di crescita e sulle condizioni di crescita e l’estrazione delle cellule pulita e precisa in modo semplice ed economico. L’estrazione richiede solo un microscopio fluorescente accoppiato con lo strumento di illuminazione modellata e può essere eseguita in modo sequenziale per isolare più bersagli cellulari. Ogni estrazione richiede 5-10 minuti per essere eseguita e fino a 30 colonie mirate sono state rimosse da un singolo idrogel. Un vantaggio chiave dell’approccio è la sua adattabilità a una varietà di diversi formati di test, come dimostrato qui con lo screening sia da idrogel sfusi che da array di microwell. Il processo di separazione in entrambi i formati è stato utilizzato con successo per isolare i batteri che mostrano un comportamento di crescita unico per la genotipizzazione a valle dopo la coltura e l’osservazione microscopica, una capacità critica per collegare il genotipo cellulare al fenotipo. Ad oggi, le caratterizzazioni genomiche dei batteri estratti da queste interfacce hanno incluso il sequenziamento amplicon 16S per identificare collezioni multi-specie di batteri da microbiomi ambientali che generano un comportamento di crescita emergente18e per il sequenziamento dell’intero genoma per identificare con successo mutazioni genetiche che causano rari profili di crescita nelle cellule presenti all’interno di librerie mutanti19.
L’utilizzo di idrogel sfusi per lo screening e l’isolamento cellulare è il formato più semplice e diretto. Gli idrogel fotodegradabili alla rinfusa si formano rapidamente (25 minuti) dopo aver miscelato i precursori su coperture di vetro trasparente per incapsulare le cellule in una matrice di coltura cellulare 3D che viene ripresa con un microscopio a fluorescenza verticale o invertita standard. Pertanto, il metodo ha il potenziale per essere traslazionale per i comuni laboratori di microbiologia che non dispongono di risorse o competenze di microfabbricazione. Uno svantaggio di questo formato è che le cellule sono orientate in modo casuale attraverso l’idrogel tridimensionale. Pertanto, le cellule possono apparire fuori dal piano focale quando l’imaging con obiettivi di ingrandimento più elevati e l’estrazione può essere difficile se le colonie cellulari sono orientate troppo vicine l’una all’altra o se c’è una sovrapposizione verticale di colonie. Depositare un idrogel sottile (<13 μm) come descritto è fondamentale per mitigare questo inconveniente. L'esposizione in modelli di luce incrociata spezzata (Figura 4B) è preferibile qui, poiché questo modello si traduce in cellule prive di idrogel che hanno un’esposizione minima alla luce UV e possono essere facilmente recuperate attraverso la placcatura.
Al contrario, il formato dell’array microwell fornisce un’interfaccia più ben controllata, poiché le cellule batteriche sono suddivise in microwell discreti che fungono da piccoli siti di coltura oco-colture 17,18,26. Le dimensioni, il passo e la densità di Microwell sono fabbricati con precisione utilizzando tecniche fotolitografiche standard. Rispetto agli idrogel sfusi, i batteri possono essere estratti da array di microwell con un più alto grado di specificità e una minore possibilità di contaminazione incrociata, poiché le cellule sono presenti solo in posizioni predefinite, non disperse casualmente in tutto l’idrogel. La concentrazione e i rapporti delle cellule batteriche nella soluzione di semina possono anche essere variati per controllare la quantità e la composizione dell’inoculo del microwell attraverso un processo di semina che è stato caratterizzato in precedenti rapporti26, dando all’utente flessibilità nella progettazione sperimentale dello schermo. Lo svantaggio principale dello screening con il formato array microwell è il tempo e le competenze aggiuntivi necessari per la microfabbricazione. La fabbricazione di micro pozzi è stata stimata a un costo di ~ $ 10 per array, che include i costi dei materiali e le spese per le camere bianche. Inoltre, gli array di microwell sono tradizionalmente realizzati in silicio, il che può causare difficoltà di imaging poiché i substrati non sono trasparenti. Inoltre, un’elevata quantità di diffusione della luce dalla superficie del silicio può limitare l’imaging all’interno dei micro pozzetti e può ridurre la risoluzione del modello durante l’esposizione all’idrogel con la luce UV dallo strumento di illuminazione modellata (visto nella Figura 8A,B). Microwell simili sono stati fabbricati su substrati di quarzo trasparente per affrontare questi tipi di limitazioni27; tuttavia, questa fabbricazione è considerevolmente più difficile. L’esposizione a modelli ad anello che illuminano il perimetro del pozzo è preferibile qui per rilasciare cellule libere dai pozzetti riducendo al minimo l’esposizione ai raggi UV.
Il problema più comune che si verifica in entrambi i formati è il distacco dell’idrogel dal substrato sottostante durante la coltura a causa del gonfiore dell’idrogel. Se questo è un problema per gli idrogel sfusi, la presenza, la densità e l’uniformità dei gruppi tiolici nello strato di attacco chimico (MTPS) attraverso la superficie del coperchio di vetro di base devono essere verificate utilizzando una tecnica di caratterizzazione superficiale appropriata (XPS, ATR-FTIR, AFM, ecc.). Basse densità di gruppi tiolici superficiali a causa di una funzionalizzazione superficiale inefficiente possono portare a una debole interazione tra il substrato e l’idrogel. Se si verifica un basso livello di tiolazione superficiale, deve essere controllata la stabilità della soluzione MTPS. Si deve prestare attenzione nella pulizia iniziale del vetrino per assicurare una superficie pulita prima del trattamento MTPS e si deve prestare attenzione per garantire l’uso di toluene anidro durante la reazione superficiale MTPS (Protocollo Sezione 4). Nel caso di array di microwell, le superfici non sono tiolate e gli idrogel si attaccano invece attraverso il riempimento parziale dei pozzetti con l’idrogel, che ancora l’idrogel al substrato di silicio17. Se il distacco dell’idrogel è un problema in questo sistema, è possibile incidere più microwell o altre caratteristiche su microscala nell’array per ancorare ulteriormente l’idrogel al substrato per promuovere un attacco più forte.
Una limitazione della tecnica in entrambi i formati è la limitata stabilità degli idrogel in presenza di batteri. È stato notato che alcuni batteri, come A. tumefaciens, possono degradare l’idrogel nel corso di 5-7 giorni17,19,il che limita il tempo dell’esperimento. Sono in corso le attuali indagini sui meccanismi di degradazione batterica; si ipotizza che i gruppi estere presenti dai monomeri diacrilato siano soggetti a idrolisi mediata da batteri e/o degradazione enzimatica, come notato in altri sistemi17. Lo sviluppo di sostanze chimiche idrogel più stabili prolungherà il tempo in cui i batteri possono rimanere nell’idrogel e estenderà lo schermo ai microrganismi con tassi di crescita più lenti. Una seconda limitazione è che in entrambi i formati, il recupero e l’estrazione cellulare avvengono in un ambiente aperto, con conseguenti volumi di estrazione relativamente elevati (30-100 μL), che possono essere suscettibili alla contaminazione esterna. Pertanto, è necessario prestare attenzione per garantire che siano presenti abbastanza cellule dalle colonie bersaglio riducendo al minimo il volume della soluzione di estrazione. Per ottenere abbastanza cellule per la placcatura e il recupero o per l’estrazione di materiale del DNA, è stato osservato che negli idrogel sfusi, le cellule devono essere coltivate abbastanza a lungo da raggiungere diametri di colonie di almeno 10 μm. Per ridurre il volume richiesto per l’estrazione cellulare, è stato osservato che l’uso di una siringa e di un tubo a microlitri (Figura 2) era più efficiente del pipettaggio. Il tubo ha permesso di prelevare gli isolati dal punto di rilascio in modo più accurato, richiedendo meno volume di soluzione e riducendo la possibilità di contaminazione.
Il lavoro futuro prevede la comprensione dell’effetto delle proprietà meccaniche dell’idrogel sulla crescita cellulare, poiché le caratteristiche meccaniche di questi idrogel sono ben controllate dalla selezione di appropriati precursori monomerici a base di PEG di vari pesi molecolari28e le interazioni meccaniche probabilmente svolgono un ruolo importante nel comportamento dei batteri29. Poiché i materiali idrogel possono essere facilmente incorporati in una varietà di sistemi e dispositivi diversi, l’ulteriore sviluppo si concentra anche sull’integrazione di questo materiale in sistemi microfluidici. Ciò ridurrebbe la soluzione di estrazione a volumi da femtoliter a picoliter, rispetto ai tradizionali volumi da 30-100 μL attualmente richiesti nel formato a raccolta aperta. Volumi di soluzioni più piccoli ridurrebbero notevolmente la potenziale contaminazione e sposterebbero l’approccio verso l’isolamento e la caratterizzazione di singole cellule.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata supportata dal NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |