Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.
Biologen hebben lang geprobeerd de relatie tussen fenotype en genotype te begrijpen. Om dit verband beter te begrijpen, is het cruciaal om praktische technologieën te ontwikkelen die microscopische celscreening koppelen aan celisolatie met een hoge zuiverheid voor downstream genetische analyse. Hier wordt het gebruik van fotoafbreekbare poly(ethyleenglycol)hydrogels voor screening en isolatie van bacteriën met unieke groeifenotypen uit heterogene celpopulaties beschreven. De methode is gebaseerd op het inkapselen of insluiten van cellen met de hydrogel, gevolgd door cultuur, microscopische screening en vervolgens het gebruik van een hoge resolutie lichtpatroontool voor spatiotemporale controle van hydrogelafbraak en afgifte van geselecteerde cellen in een oplossing voor ophalen. Het toepassen van verschillende lichtpatronen zorgt voor controle over de morfologie van de geëxtraheerde cel, en patronen zoals ringen of kruisen kunnen worden gebruikt om cellen met minimale directe blootstelling aan UV-licht op te halen om DNA-schade aan de isolaten te beperken. Bovendien levert de lichtpatroontool een instelbare lichtdosis om verschillende degradatie- en celafgiftesnelheden te bereiken. Het maakt degradatie bij hoge resolutie mogelijk, waardoor celopvraging met ruimtelijke precisie op micronschaal mogelijk is. Hier wordt het gebruik van dit materiaal om bacteriën te screenen en op te halen uit zowel bulkhydrogels als microgefabriceerde lab-on-a-chip-apparaten gedemonstreerd. De methode is goedkoop, eenvoudig en kan worden gebruikt voor veel voorkomende en opkomende toepassingen in de microbiologie, waaronder isolatie van bacteriestammen met zeldzame groeiprofielen uit mutantenbibliotheken en isolatie van bacteriële consortia met emergente fenotypes voor genomische karakteriseringen.
Isolatie van cellen met uniek gedrag uit een complexe en heterogene omgeving is fundamenteel voor het verkrijgen van genetische informatie in de biologie1. In de microbiologie wordt de selectie en isolatie van zeldzame of unieke microben na observatie belangrijk in veel toepassingen die een verband vereisen tussen genomische informatie en waarneembare fenotypische informatie. Deze toepassingen omvatten het selecteren van fenotypisch zeldzame stammen uit mutantenbibliotheken2,het selecteren van keystone-micro-organismen uit complexe microbiële gemeenschappen3,4en het selecteren van fenotypisch zeldzame maar belangrijke bacteriën uit isogene populaties. Isolatie van levensvatbare maar niet-cultureerbare cellen (VBNC) van een bacteriepopulatie is een belangrijk voorbeeld van de laatste, waarbij cellen met het VBNC-fenotype vaak verborgen zijn in bacteriepopulaties bij 1:102 tot 1:105 verhoudingen5,6. Vanwege de wijdverspreide problemen bij het isoleren van bacteriën, blijft veel onbekend over veel fenotypisch zeldzame micro-organismen. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van celisolatietechnieken om eerst de doelcel of cellen uit een mengsel te identificeren en ze vervolgens op te halen en te isoleren voor downstream moleculaire analyse7.
Enkele van de meest voorkomende methoden voor celisolatie zijn flowcytometrie en fluorescerende geactiveerde celsortering(FACS) 8,immunomagnetische scheiding9,10en microfluïdica11. Hoewel deze isolatiemethoden een hoge waarde hebben, hebben ze ook nadelen die het gebruik ervan beperken. FACS kan bijvoorbeeld routinematige microbiële isolatie op het niveau van één cel bieden voor follow-up genomische analyse3, maar wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid en kosten, evenals stroomafwaartse besmettingsproblemen11. Microfluïdische benaderingen zoals microfluïdische flowcytometrie hebben veel aandacht gekregen, wat, in vergelijking met conventionele flowcytometrie, een aanzienlijke vermindering van het vereiste monstervolume mogelijk maakt12. Het scheiden en ophalen van een individuele of kleine verzameling cellen van microfluïdische apparaten is echter vaak een uitdagend probleem dat meestal een complexere installatie en apparaatontwerp vereist13. Veel microfluïdische benaderingen karakteriseren cellen genetisch voordat ze worden ingevoerd en waargenomen in een apparaat14, waardoor het aantal unieke soorten dat wordt waargenomen bij het uitvoeren van een functioneel scherm wordt beperkt. Gezien deze beperkingen is verdere innovatie van zowel methoden als materialen die praktisch zijn voor celscreening en isolatie vereist voor wijdverbreid gebruik in veel laboratoria.
Dit artikel presenteert een nieuwe, op materialen gebaseerde benadering voor het screenen en isoleren van bacteriën. De methode maakt gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor celinkapseling, kweek, microscopische observatie en on-demand afgifte en herstel van gerichte bacteriën met unieke fenotypen. Hydrogels zijn ontworpen om een maaswijdte van 10 nm te bevatten, waarbij elke crosslink o-nitrobenzylgroepen15bevat. Het materiaal kapselt cellen in of vangt ze op voor observatie en maakt de diffusie van voedingsstoffen en afvalproducten van en naar cellen voor kweek mogelijk. Door het materiaal bloot te stellen aan een 365 nm UV-lichtbron met een patroon door een rechtopstaande microscoop, kan de hydrogel lokaal worden afgebroken door fotocleavage van o-nitrobenzylgroepen16,17. Afbraak leidt tot de selectieve afgifte van cellen voor herstel voor downstream-analyse, inclusief genomische en mogelijk proteomische en transcriptomische analyse. De experimentele opzet en het protocol zijn relatief eenvoudig, goedkoop en translationeel naar microbiologische laboratoria. Het vereist alleen celinkapseling door hydrogelvorming, observatie van gevangen cellen met een rechtopstaande brightfield- en fluorescentiemicroscoop en de verlichting van interessante cellen met een uv-lichtbron met patroon om op te halen.
Een belangrijk voordeel van deze op materialen gebaseerde benadering van screening is het aanpassingsvermogen aan verschillende screeningformaten. In het meest basale formaat kan het materiaal worden gebruikt voor screening door een heterogene celverzameling in bulkhydrogels in te kapselen. Cellen worden vervolgens geobserveerd voor het gewenste fenotype en individuele cellen van belang worden verwijderd voor genomische karakterisering. In meer uitgebreide formaten kan het materiaal ook worden geïntegreerd in lab-on-a-chip-apparaten om nauwkeurige celafgifte en -herstel uit de gewenste delen van het apparaat te bieden. Beide formaten worden hier beschreven en beide hebben recente nieuwe microbiële screening- en selectietoepassingen mogelijk gemaakt17,18,19. De methode wordt hier gedemonstreerd met model Gram-negatieve organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) en een model Gram-positief organisme (Bacillus subtilis) en is gemakkelijk uitgebreid naar een verscheidenheid aan andere bacteriën.
Dit manuscript demonstreert het gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor het screenen en isoleren van bacteriën. Het materiaal en de aanpak maken een cultuur met hoge doorvoer, controle over groeimedia en groeiomstandigheden en schone en nauwkeurige celextractie op een eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Extractie vereist alleen een fluorescerende microscoop in combinatie met het patroonverlichtingsgereedschap en kan op een sequentiële manier worden gedaan om meerdere celdoelen te isoleren. Elke extractie duurt 5-10 minuten om uit te voeren en tot 30 gerichte kolonies zijn verwijderd uit een enkele hydrogel. Een belangrijk voordeel van de aanpak is het aanpassingsvermogen aan een verscheidenheid aan verschillende testformaten, zoals hier wordt aangetoond met screening van zowel bulkhydrogels als microwell-arrays. Het scheidingsproces in beide formaten is met succes gebruikt om bacteriën te isoleren die uniek groeigedrag vertonen voor downstream genotypering na kweek en microscopische observatie, een kritisch vermogen voor het verbinden van celgenotype met fenotype. Tot op heden hebben genomische karakteriseringen van bacteriën geëxtraheerd uit deze interfaces 16S amplicon sequencing opgenomen om multi-species collecties van bacteriën uit omgevingsmicrobiomen te identificeren die emergent groeigedrag genereren18, en voor whole-genome sequencing om met succes genetische mutaties te identificeren die zeldzame groeiprofielen veroorzaken in cellen die aanwezig zijn in mutantenbibliotheken19.
Het gebruik van bulkhydrogels voor celscreening en isolatie is het meest eenvoudige en eenvoudige formaat. Bulk fotoafbreekbare hydrogels vormen zich snel (25 min) na het mengen van de voorlopers over transparante glazen coverslips om cellen in te kapselen in een 3D-celkweekmatrix die wordt afgebeeld met een standaard rechtopstaande of omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De methode heeft dus het potentieel om translationeel te zijn naar gemeenschappelijke microbiologische laboratoria die geen microfabricagebronnen of expertise hebben. Een nadeel van dit formaat is dat cellen willekeurig georiënteerd zijn over de driedimensionale hydrogel. Daarom kunnen cellen uit het brandpuntsvlak verschijnen bij beeldvorming met hogere vergrotingsdoelstellingen en extractie kan moeilijk zijn als celkolonies te dicht bij elkaar zijn georiënteerd of als er een verticale overlay van kolonies is. Het afzetten van een dunne hydrogel (<13 μm) zoals beschreven is van cruciaal belang om dit nadeel te verminderen. Blootstelling aan gebroken kruislichtpatronen (figuur 4B) heeft hier de voorkeur, omdat dit patroon resulteert in cellen vrij van de hydrogel die minimale blootstelling aan UV-licht hebben en gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen door plating.
Daarentegen biedt het microwell array-formaat een beter gecontroleerde interface, omdat bacteriecellen worden verdeeld in discrete microwells die dienen als kleine cultuur of co-culturen sites17,18,26. Microwell dimensie, toonhoogte en dichtheid zijn nauwkeurig vervaardigd met behulp van standaard fotolithografische technieken. In vergelijking met bulkhydrogels kunnen bacteriën worden geëxtraheerd uit microwell-arrays met een hogere mate van specificiteit en een lagere kans op kruisbesmetting, omdat de cellen alleen aanwezig zijn op vooraf gedefinieerde locaties, niet willekeurig verspreid over de hydrogel. De concentratie en verhoudingen van bacteriecellen in de zaaioplossing kunnen ook worden gevarieerd om de hoeveelheid en samenstelling van het microwell-entmateriaal te regelen door middel van een zaaiproces dat is gekarakteriseerd in eerdere rapporten26, waardoor de gebruiker flexibiliteit krijgt in het experimentele ontwerp van het scherm. Het belangrijkste nadeel van screening met het microwell array-formaat is de extra tijd en expertise die nodig is voor microfabricage. De fabricage van microwells kostte naar schatting ~ $ 10 per array, inclusief materiaalkosten en cleanroomkosten. Bovendien worden microwells-arrays traditioneel gemaakt van silicium, wat beeldvormingsproblemen kan veroorzaken omdat de substraten niet transparant zijn. Bovendien kan een grote hoeveelheid lichtverstrooiing van het siliciumoppervlak de beeldvorming binnen de microwells beperken en de patroonresolutie tijdens blootstelling aan hydrogel verminderen met UV-licht van het patroonverlichtingsgereedschap (te zien in figuur 8A,B). Soortgelijke microwells zijn vervaardigd op transparante kwartssubstraten om dit soort beperkingen aan te pakken27; deze fabricage is echter aanzienlijk moeilijker. Blootstelling aan ringpatronen die de omtrek van de put verlichten, heeft hier de voorkeur om vrije cellen uit de putten vrij te maken en tegelijkertijd uv-blootstelling te minimaliseren.
Het meest voorkomende probleem dat in beide formaten optreedt, is het losmaken van de hydrogel van het onderliggende substraat tijdens het kweken als gevolg van hydrogelzwelling. Als dit een probleem is voor bulkhydrogels, moeten de aanwezigheid, dichtheid en uniformiteit van thiolgroepen in de chemische (MTPS) bevestigingslaag over het oppervlak van de basisglasafdekkingslip worden geverifieerd met behulp van een geschikte oppervlaktekarakteriseringstechniek (XPS, ATR-FTIR, AFM, enz.). Lage dichtheden van oppervlaktetholgroepen als gevolg van inefficiënte oppervlaktefunctionalisatie kunnen leiden tot een zwakke interactie tussen het substraat en de hydrogel. Als een laag niveau van oppervlaktetholatie optreedt, moet de stabiliteit van de MTPS-oplossing worden gecontroleerd. Bij de eerste reiniging van de glasplaat moet ervoor worden gezorgd dat er voorafgaand aan de MTPS-behandeling een schoon oppervlak ontstaat, en er moet voor worden gezorgd dat watervrij tolueen wordt gebruikt tijdens de MTPS-oppervlaktereactie (protocolsectie 4). In het geval van microwell-arrays worden oppervlakken niet ge thioleerd en hechten hydrogels zich in plaats daarvan door de gedeeltelijke vulling van de putten met de hydrogel, die de hydrogel verankert aan het siliciumsubstraat17. Als hydrogelloslating een probleem is in dit systeem, kunnen meer microwells of andere microschaalfuncties in de array worden geëtst om de hydrogel verder aan het substraat te verankeren om een sterkere hechting te bevorderen.
Een beperking van de techniek in beide formaten is de beperkte stabiliteit van de hydrogels in aanwezigheid van bacteriën. Er is opgemerkt dat sommige bacteriën, zoals A. tumefaciens, de hydrogel in de loop van 5-7 dagen17,19kunnen afbreken, wat de experimenteertijd beperkt. Het huidige onderzoek naar de mechanismen van bacteriële afbraak is aan de gang; er wordt verondersteld dat de estergroepen die aanwezig zijn uit de diacrylaatmonomeren onderhevig zijn aan door bacteriën gemedieerde hydrolyse en/of enzymatische afbraak, zoals opgemerkt in andere systemen17. Het ontwikkelen van stabielere hydrogelchemie zal de tijd verlengen dat bacteriën in de hydrogel kunnen blijven en zal het scherm uitbreiden naar micro-organismen met langzamere groeisnelheden. Een tweede beperking is dat in beide formaten celterugwinning en -extractie plaatsvinden in een open omgeving, wat resulteert in relatief hoge extractievolumes (30-100 μL), die gevoelig kunnen zijn voor verontreiniging van buitenaf. Er moet dus voor worden gezorgd dat er voldoende cellen aanwezig zijn uit de doelkolonies, terwijl het volume van de extractieoplossing wordt geminimaliseerd. Om voldoende cellen te verkrijgen voor plating en herstel of voor extractie van DNA-materiaal, werd waargenomen dat in bulkhydrogels cellen lang genoeg moeten worden gekweekt om koloniediameters van ten minste 10 μm te bereiken. Om het vereiste volume voor celextractie te verlagen, werd waargenomen dat het gebruik van een microliterspuit en -slang (figuur 2) efficiënter was dan pipetteren. Met de buizen konden de isolaten nauwkeuriger van het afgiftepunt worden getrokken, waardoor minder oplossingsvolume nodig was en de kans op verontreiniging werd verlaagd.
Toekomstig werk omvat het begrijpen van het effect van hydrogel mechanische eigenschappen op celgroei, aangezien mechanische kenmerken van deze hydrogels goed worden gecontroleerd door de selectie van geschikte PEG-gebaseerde monomeerprecursoren van verschillende molecuulgewichten28, en mechanische interacties spelen waarschijnlijk een belangrijke rol in het gedrag van bacteriën29. Omdat de hydrogelmaterialen gemakkelijk kunnen worden opgenomen in een verscheidenheid aan verschillende systemen en apparaten, is de verdere ontwikkeling ook gericht op de integratie van dit materiaal in microfluïdische systemen. Dit zou de extractieoplossing reduceren tot femtoliter tot picoliter volumes, vergeleken met traditionele 30-100 μL volumes die momenteel nodig zijn in het open collectieformaat. Kleinere oplossingsvolumes zouden de potentiële besmetting aanzienlijk verminderen en de benadering van eencellige isolatie en karakterisering verplaatsen.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door NSF CAREER Award #1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |