Se informa del uso de hidrogeles fotodegradables para aislar células bacterianas mediante el uso de una herramienta de pattering de luz de alta resolución. Se revisan los procedimientos experimentales esenciales, los resultados y las ventajas del proceso. El método permite el aislamiento rápido y económico de bacterias objetivo que muestran funciones raras o únicas de comunidades o poblaciones heterogéneas.
Los biólogos han intentado durante mucho tiempo comprender la relación entre el fenotipo y el genotipo. Para comprender mejor esta conexión, es crucial desarrollar tecnologías prácticas que combinen la detección celular microscópica con el aislamiento celular de alta pureza para el análisis genético posterior. Aquí, se describe el uso de hidrogeles de poli(etilenglicol) fotodegradables para la detección y el aislamiento de bacterias con fenotipos de crecimiento únicos de poblaciones celulares heterogéneas. El método se basa en encapsular o atrapar células con el hidrogel, seguido de cultivo, detección microscópica, luego uso de una herramienta de patrón de luz de alta resolución para el control espaciotemporal de la degradación del hidrogel y la liberación de células seleccionadas en una solución para su recuperación. La aplicación de diferentes patrones de luz permite el control sobre la morfología de la célula extraída, y se pueden usar patrones como anillos o cruces para recuperar células con una exposición mínima directa a la luz UV para mitigar el daño del ADN a los aislados. Además, la herramienta de modelado de luz ofrece una dosis de luz ajustable para lograr varias tasas de degradación y liberación celular. Permite la degradación a alta resolución, lo que permite la recuperación celular con precisión espacial a escala de micras. Aquí, se demuestra el uso de este material para detectar y recuperar bacterias tanto de hidrogeles a granel como de dispositivos microfabricados de laboratorio en un chip. El método es barato, simple y se puede utilizar para aplicaciones comunes y emergentes en microbiología, incluido el aislamiento de cepas bacterianas con perfiles de crecimiento raros de bibliotecas mutantes y el aislamiento de consorcios bacterianos con fenotipos emergentes para caracterizaciones genómicas.
El aislamiento de células con comportamientos únicos de un entorno complejo y heterogéneo es fundamental para obtener información genética en biología1. En microbiología, la selección y el aislamiento de microbios raros o únicos después de la observación se vuelve importante en muchas aplicaciones que requieren una conexión entre la información genómica y la información fenotípica observable. Estas aplicaciones incluyen la selección de cepas fenotípicamente raras de bibliotecas mutantes2,la selección de microorganismos clave de comunidades microbianas complejas3,4y la selección de bacterias fenotípicamente raras pero importantes de poblaciones isogénicas. El aislamiento de células viables pero no cultivables (VBNC) de una población de bacterias es un ejemplo importante de esto último, donde las células con el fenotipo VBNC a menudo se ocultan en poblaciones de bacterias a 1:102 a 1:105 proporciones5,6. Debido a las dificultades generalizadas en el aislamiento de bacterias, queda mucho desconocido sobre muchos microorganismos fenotípicamente raros. Estas limitaciones enfatizan la necesidad de técnicas de aislamiento celular para identificar primero la célula o células objetivo de una mezcla y luego recuperarlas y aislarlas para el análisis molecular posterior7.
Algunos de los métodos más comúnmente establecidos de aislamiento celular incluyen citometría de flujo y clasificación celular activada fluorescente (FACS)8,separación inmunomagnética9,10y microfluídica11. Si bien estos métodos de aislamiento tienen un alto valor, también tienen inconvenientes que limitan su uso. Por ejemplo, EL FACS puede proporcionar aislamiento microbiano de rutina a nivel de una sola célula para el análisis genómico de seguimiento3, pero a menudo está limitado por su disponibilidad y gasto, así como por los problemas de contaminación aguasabajo 11. Los enfoques basados en microfluídica, como la citometría de flujo microfluídico, han recibido mucha atención, lo que, en comparación con la citometría de flujo convencional, permite una reducción significativa en el volumen de muestra requerido12. Sin embargo, la separación y recuperación de una colección individual o pequeña de células de dispositivos microfluídicos es a menudo un problema desafiante que generalmente requiere una configuración y un diseño de dispositivos más complejos13. Muchos enfoques basados en microfluidos caracterizan genéticamente las células antes de que se introduzcan y observen en un dispositivo14,lo que limita el número de especies únicas observadas al realizar una pantalla funcional. Dadas estas limitaciones, se requiere una mayor innovación tanto de métodos como de materiales que sean prácticos para la detección y el aislamiento celular para su uso generalizado en muchos laboratorios.
Este documento presenta un nuevo enfoque basado en materiales para la detección y el aislamiento de bacterias. El método utiliza hidrogeles fotodegradables para la encapsulación celular, el cultivo, la observación microscópica y la liberación y recuperación bajo demanda de bacterias objetivo con fenotipos únicos. Los hidrogeles están diseñados para contener un tamaño de malla de 10 nm, donde cada reticulación contiene grupos o-nitrobencil15. El material encapsula o atrapa las células para su observación al tiempo que permite la difusión de nutrientes y productos de desecho hacia y desde las células para su cultivo. La exposición del material a una fuente de luz UV estampada de 365 nm a través de un microscopio vertical permite la degradación local del hidrogel a través del fotocierre de los grupos o-nitrobencil16, 17. La degradación desencadena la liberación selectiva de células para su recuperación para el análisis posterior, incluido el análisis genómico y, potencialmente, proteómico y transcriptómico. La configuración experimental y el protocolo son relativamente simples, económicos y traslacionales a los laboratorios de microbiología. Solo requiere encapsulación celular a través de la formación de hidrogel, observación de células capturadas con un microscopio vertical de campo brillante y fluorescencia, y la iluminación de células de interés con una fuente de luz UV patrón para su recuperación.
Una ventaja clave de este enfoque basado en materiales para la detección es su adaptabilidad a diferentes formatos de detección. En su formato más básico, el material se puede utilizar para el cribado encapsulando una colección de células heterogéneas en hidrogeles a granel. Luego se observan células para el fenotipo deseado, y se eliminan células individuales de interés para la caracterización genómica. En formatos más elaborados, el material también se puede integrar en dispositivos de laboratorio en un chip para proporcionar una liberación y recuperación celular precisa de las áreas deseadas del dispositivo. Ambos formatos se describen aquí, y ambos han permitido nuevas aplicaciones recientes de detección y selección microbiana17,18,19. El método se demuestra aquí con organismos Gram-negativos modelo(Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens)y un modelo de organismo Gram-positivo(Bacillus subtilis)y se ha extendido fácilmente a una variedad de otras bacterias.
Este manuscrito demuestra el uso de hidrogeles fotodegradables para la detección y aislamiento de bacterias. El material y el enfoque permiten un cultivo de alto rendimiento, control sobre los medios de crecimiento y las condiciones de crecimiento, y extracción celular limpia y precisa de una manera directa y rentable. La extracción solo requiere un microscopio fluorescente junto con la herramienta de iluminación con patrones y se puede hacer de manera secuencial para aislar múltiples objetivos celulares. Cada extracción tarda de 5 a 10 minutos en realizarse, y se han eliminado hasta 30 colonias específicas de un solo hidrogel. Una ventaja clave del enfoque es su adaptabilidad a una variedad de formatos de ensayo diferentes, como se demuestra aquí con la detección de hidrogeles a granel y matrices de micropocillos. El proceso de separación en ambos formatos se ha utilizado con éxito para aislar bacterias que muestran un comportamiento de crecimiento único para el genotipo posterior después del cultivo y la observación microscópica, una capacidad crítica para conectar el genotipo celular con el fenotipo. Hasta la fecha, las caracterizaciones genómicas de bacterias extraídas de estas interfaces han incluido la secuenciación de amplicon 16S para identificar colecciones multiespecie de bacterias de microbiomas ambientales que generan un comportamiento de crecimiento emergente18,y para la secuenciación del genoma completo para identificar con éxito mutaciones genéticas que causan perfiles de crecimiento raros en células presentes dentro de bibliotecas mutantes19.
El uso de hidrogeles a granel para la detección y el aislamiento celular es el formato más directo y simple. Los hidrogeles fotodegradables a granel se forman rápidamente (25 min) después de mezclar los precursores sobre cubiertas de vidrio transparente para encapsular las células en una matriz de cultivo celular 3D que se visualiza con un microscopio de fluorescencia vertical o invertido estándar. Por lo tanto, el método tiene el potencial de ser traslacional a laboratorios de microbiología comunes que no tienen recursos o experiencia en microfabricación. Un inconveniente de este formato es que las células están orientadas aleatoriamente a lo largo del hidrogel tridimensional. Por lo tanto, las células pueden aparecer fuera del plano focal cuando las imágenes con objetivos de aumento más altos y la extracción pueden ser difíciles si las colonias celulares están orientadas demasiado cerca unas de otras o si hay una superposición vertical de colonias. Depositar un hidrogel delgado (<13 μm) como se describe es fundamental para mitigar este inconveniente. La exposición en patrones de luz cruzada rotos(Figura 4B)es preferible aquí, ya que este patrón da como resultado células libres del hidrogel que tienen una exposición mínima a la luz UV y se pueden recuperar fácilmente a través del revestimiento.
En contraste, el formato de matriz de micropocillos proporciona una interfaz más bien controlada, ya que las células bacterianas se dividen en micropocillos discretos que sirven como pequeños sitios de cultivo o cocultivos17,18,26. La dimensión, el paso y la densidad de los micropocillos se fabrican con precisión utilizando técnicas fotolitográficas estándar. En comparación con los hidrogeles a granel, las bacterias se pueden extraer de matrices de micropocillos con un mayor grado de especificidad y menor probabilidad de contaminación cruzada, ya que las células solo están presentes en lugares predefinidos, no dispersos aleatoriamente por todo el hidrogel. La concentración y las proporciones de células bacterianas en la solución de siembra también se pueden variar para controlar la cantidad y composición del inóculo micropocillo a través de un proceso de siembra que se ha caracterizado en informes anteriores26,dando al usuario flexibilidad en el diseño experimental de la pantalla. El principal inconveniente de la detección con el formato de matriz de micropocillos es el tiempo y la experiencia adicionales necesarios para la microfabricación. Se estimó que la fabricación de micropocillos costaba ~ $ 10 por matriz, lo que incluye los costos de materiales y los gastos de salas limpias. Además, las matrices de micropocillos están hechas tradicionalmente de silicio, lo que puede causar dificultades de imagen ya que los sustratos no son transparentes. Además, una gran cantidad de dispersión de luz de la superficie de silicio puede limitar las imágenes dentro de los micropocillos y puede disminuir la resolución del patrón durante la exposición al hidrogel con luz UV de la herramienta de iluminación con patrones (visto en la Figura 8A,B). Se han fabricado micropocillos similares sobre sustratos de cuarzo transparente para abordar este tipo de limitaciones27; sin embargo, esta fabricación es considerablemente más difícil. La exposición a patrones de anillo que iluminan el perímetro del pozo es preferible aquí para liberar células libres de los pozos mientras se minimiza la exposición a los rayos UV.
El problema más común que ocurre en cualquiera de los formatos es el desprendimiento del hidrogel del sustrato subyacente durante el cultivo debido a la hinchazón del hidrogel. Si esto es un problema para los hidrogeles a granel, la presencia, densidad y uniformidad de los grupos tiol en la capa de unión química (MTPS) a través de la superficie de la cubierta de vidrio base debe verificarse utilizando una técnica de caracterización de superficie adecuada (XPS, ATR-FTIR, AFM, etc.). Las bajas densidades de los grupos tiol de la superficie debido a la funcionalización ineficiente de la superficie pueden conducir a una interacción débil entre el sustrato y el hidrogel. Si se produce un bajo nivel de tiolación superficial, se debe verificar la estabilidad de la solución MTPS. Se debe tener cuidado en la limpieza inicial del portaobjetos de vidrio para asegurar una superficie limpia antes del tratamiento con MTPS, y se debe tener cuidado para garantizar el uso de tolueno anhidro durante la reacción superficial de MTPS (Protocolo Sección 4). En el caso de las matrices de micropocillos, las superficies no se tiolan, y los hidrogeles se unen a través del llenado parcial de los pozos con el hidrogel, que ancla el hidrogel al sustrato de silicio17. Si el desprendimiento de hidrogel es un problema en este sistema, se pueden grabar más micropocillos u otras características de microescala en la matriz para anclar aún más el hidrogel al sustrato para promover una unión más fuerte.
Una limitación de la técnica en cualquiera de los formatos es la estabilidad limitada de los hidrogeles en presencia de bacterias. Se ha observado que algunas bacterias, como A. tumefaciens,pueden degradar el hidrogel en el transcurso de 5-7 días17,19,lo que limita el tiempo del experimento. La investigación actual de los mecanismos de degradación bacteriana está en marcha; se plantea la hipótesis de que los grupos éster presentes a partir de los monómeros de diacrilato están sujetos a hidrólisis mediada por bacterias y/o degradación enzimática, como se observa en otros sistemas17. El desarrollo de sustancias químicas de hidrogel más estables extenderá el tiempo que las bacterias pueden permanecer en el hidrogel y extenderá la pantalla a microorganismos con tasas de crecimiento más lentas. Una segunda limitación es que en ambos formatos, la recuperación y extracción celular ocurren en un ambiente abierto, lo que resulta en volúmenes de extracción relativamente altos (30-100 μL), que pueden ser susceptibles a la contaminación externa. Por lo tanto, se debe tener cuidado para garantizar que haya suficientes células presentes en las colonias objetivo al tiempo que se minimiza el volumen de la solución de extracción. Para obtener suficientes células para el recubrimiento y la recuperación o para la extracción de material de ADN, se observó que en hidrogeles a granel, las células deben cultivarse el tiempo suficiente para alcanzar diámetros de colonia de al menos 10 μm. Para reducir el volumen requerido para la extracción celular, se observó que el uso de una jeringa de microlitro y un tubo (Figura 2) era más eficiente que el pipeteo. El tubo permitió que los aislamientos se extrajeran del punto de liberación con mayor precisión, requiriendo menos volumen de solución y reduciendo la posibilidad de contaminación.
El trabajo futuro implica comprender el efecto de las propiedades mecánicas del hidrogel en el crecimiento celular, ya que las características mecánicas de estos hidrogeles están bien controladas por la selección de precursores de monómeros apropiados basados en PEG de varios pesos moleculares28, y las interacciones mecánicas probablemente juegan un papel importante en el comportamiento de las bacterias29. Como los materiales de hidrogel se pueden incorporar fácilmente en una variedad de sistemas y dispositivos diferentes, el desarrollo posterior también se centra en la integración de este material en sistemas microfluídicos. Esto reduciría la solución de extracción a volúmenes de femtolitro a picolitros, en comparación con los volúmenes tradicionales de 30-100 μL actualmente requeridos en el formato de recolección abierta. Los volúmenes de solución más pequeños reducirían en gran medida la contaminación potencial y moverían el enfoque hacia el aislamiento y la caracterización de una sola célula.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por NSF CAREER Award # 1944791.
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 175617-25G | > 95% |
Alconox detergent powder | Alconox | 1104 | |
Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A702-500 | Certified ACS Granular |
Autoclave SK300C | Yamato Scientific | 18016 | |
Bacillus subtilis 1A1135 | Bacillus Genetic Stock Center | 1A1135 | |
Brightfield upright microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Chemical | C614-500 | For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909-500G | ACS reagent, > 99.0% |
D-Glucose (Dextrose) | VWR Amresco Life Science | 0188-1KG | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA purification kit |
DOWSIL 184 silicone elastomer base | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: -30-60 °C | |
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent | Dow Silicones Corporation | Storage temperature: < 32 C | |
EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments | EPOCH2 | |
Escherichia coli ATCC 25922 | Thermo Fisher Scientific | R19020 | |
Ethanol, anhydrous | Fisher Chemical | 459844 | |
Fisherbrand microscope cover glass | Fisher Scientific | 12540A | |
Fisherfinest premium microscope slides plain | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763-500ML | Contains inhibitor, 30 wt% in H2O |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | E5-0014-01 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
Magnesium sulfate, 7-hydrate | Macron Fine Chemicals | 6066-04 | Avantor Performance Materials, Inc. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | ACS reagent, > 99.8% |
NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | |
Nitrogen, compressed | Matheson | UN1066 | |
Oxygen plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG) | NOF America Corporation | PTE-100SH | Sunbright-PTE-100SH |
Phosphate buffered saline (PBS), 10X | VWR Amresco Life Science | K813-500ML | Store between 15 °C–30 °C |
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184 | Dow Corning | 4019862 | |
Polygon400 | Mightex | DSI-D-000 | |
Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | 25 x 75 x 1 mm |
Sodium chloride | Sigma Life Science | S5886-500G | Bioreagent, suitable for cell culture |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | BioXtra, > 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71505-250G | BioUltra, for molecular biology, > 99.0% (T) |
Stainless steel thickness gage | Precision Brand Products | 77739 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-2.5L | |
Toluene, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | 244511-1L | Anhydrous, > 99.8% |
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97% | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Tryptic soy broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | For microbiology |
Ultrasonic sonicator | Fischer Scientific | FS-110H |