בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר
Summary
כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ’ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Abstract
תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) הם תאי אנדותל מיוחדים הממוקמים בממשק שבין מחזור הדם לבין הפרנכימה של הכבד. ל-LSECs יש מורפולוגיה מובחנת המאופיינת בנוכחות של fenestrae ובהיעדר קרום מרתף. LSECs ממלאים תפקידים חיוניים בהפרעות פתולוגיות רבות בכבד, כולל חוסר ויסות מטבולי, דלקת, פיברוזיס, אנגיוגנזה וקרצינוגנזה. עם זאת, מעט מאוד פורסם על הבידוד והאפיון של LSECs. כאן, פרוטוקול זה דן בבידוד של LSEC מעכברים בריאים ולא אלכוהוליים של מחלת כבד שומני (NAFLD). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים של תאים לא-פרנצ’ימליים לטיהור LSECs. מחקר זה מאפיין LSECs באמצעות סמנים ספציפיים על ידי ציטומטריה של זרימה ומזהה את התכונות הפנוטיפיות האופייניות על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. LSECs שבודדו בעקבות פרוטוקול זה יכולים לשמש למחקרים פונקציונליים, כולל מבחני הידבקות וחדירות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלול עניין מסוים. בנוסף, ניתן לאגד או להשתמש ב-LSECs אלה בנפרד, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקות, כולל תפזורת RNA-seq או תא בודד, פרוטאומי או פוספו-פרוטאומיקה, ובדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq), בין היתר. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים החוקרים את התקשורת של LSECs עם תאי כבד אחרים בבריאות ובמחלות ויאפשר הבנה מעמיקה של תפקידם של LSECs במנגנונים הפתוגניים של פגיעה חריפה וכרונית בכבד.
Introduction
תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs) מרפדים את דפנות הסינוסואידים הכבדים והם התאים הלא-פרנכימליים הנפוצים ביותר בכבד1. LSECs נבדלים מתאי אנדותל נימיים אחרים במקומות אחרים בגוף על ידי נוכחות של fenestrae והיעדר קרום מרתף קלאסי או דיאפרגמה 2,3. לפיכך, LSECs הם בעלי מאפיינים פנוטיפיים ומבניים ייחודיים המשפרים את חדירותם ואת יכולתם האנדוציטית לחסל מגוון של מקרומולקולות במחזור הדם, כולל שומנים וליפופרוטאינים. LSECs ממלאים תפקיד מרכזי בהצלבה בין תאים פרנכימליים ולא-פרנצ’ימליים, כגון תאי סטלה ותאי מערכת החיסון. LSECs הם המפתח לשמירה על הומאוסטזיס בכבד על ידי שמירה על תאי הסטלטים ותאי קופפר במצבשקט 4. LSECs מווסתים את הרכב אוכלוסיות תאי החיסון בכבד על ידי תיווך הידבקות והגירה טרנס-אנדותל של לויקוציטים במחזור 5,6. במהלך פגיעה חריפה וכרונית בכבד7, כולל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI)8, סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH)9, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC), LSECs עוברים שינויים פנוטיפיים הידועים בשם קפילאריזציה המאופיינים בהתגוננות והיווצרות של קרום מרתף10. שינויים פנוטיפיים אלה ב-LSECs קשורים לתפקוד לקוי של LSECs ולרכישת תכונות פרותרומבוטיות, פרו-דלקתיות ופרופילוגניות.
מספר שיטות לבידוד של LSECs מכבד העכבר פותחו11. טכניקות מסוימות תלויות בהפרדת תאים לא-פרנכימליים ופרנכימליים ולאחר מכן צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות כדי לטהר את ה-LSECs משברים לא-פרנצ’ימליים. המגבלה של שיטה זו היא נוכחות של מקרופאגים מזהמים בשלבים האחרונים של בידוד LSECs, אשר יכול להשפיע על טוהר של LSECsמבודדים 12. פרוטוקול זה מבוסס על זלוף קולגןאז של כבד העכבר ועל בחירה חיובית של חרוזים מגנטיים CD146+ של תאים לא-פרנצ’ימליים לטיהור LSECs. LSECs שבודדו בשיטה זו מראים טוהר גבוה ומורפולוגיה ומשומרת וכדאיות. LSECs אלה הם אופטימליים למחקרים פונקציונליים, כולל בדיקת חדירות והידבקות, כמו גם מחקרים במורד הזרם עבור מסלולי עניין. יתר על כן, עם העניין הגובר ביצירת מערכי ביג דאטה הן במחקר קליני והן במדע הגילוי, ניתן לאגד או להשתמש בנפרד ב-LSECs באיכות גבוהה אלה המבודדים מכבדים בריאים וחולים עם סטאטוהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) או מצבים אחרים, מה שמאפשר יצירת נתונים מרובי-אומיקה והשוואה בין בריאות למחלות 13,14 . בנוסף, ניתן להשתמש ב-LSECs המבודדים כדי לפתח מודלים דו-ממדיים כמו גם תלת-ממדיים במבחנה כמו אורגנואידים כדי לפענח את מסלול האיתות המופעל ב-LSECs ואת התקשורת הבין-תאית שלהם עם תאי כבד אחרים תחת גירויים רעילים שונים ובתגובה להתערבויות טיפוליות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב היד הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבידוד LSEC מכבד עכברים המורכב מפרפוזיית קולגןאז דו-שלבית ומיון תאים המופעלים על ידי מגנטית (MACS) לאחר מכן. פרוטוקול זה מורכב משלושת השלבים הבאים: (1) פרפוזיה דרך ה-PV עם מאגר נטול סידן ואחריו מאגר המכיל קולגן כדי להשיג פיזור תאי כבד; (2) הרחקה של הפטוציטים עם צנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של ה- NIH (1RO1DK122948 ל- SHI) ומנגנון המענקים של NIH Silvio O. Conte לחקר מחלות עיכול P30 (DK084567). תמיכה ניתנה גם ל- KF על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מלגות מחקר בחו”ל. אנו רוצים גם להודות לד”ר גרגורי ג’יי ג’יי גורס וסטיבן ברונק על התכנון והאופטימיזציה המקוריים שלהם של מנגנון פיזור הקולגנאז.
Materials
| 2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter | Terumo, SOmerset, NJ, USA | SR-OX2051CA | |
| 2–3-inch perfuion tray with a hole in the center | customized; made in house | ||
| 405/520 viability dye | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-205 | |
| 4-inch regular curved dressing forceps | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand silk suture | Ethicon, Raritan, NJ, USA | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, USA | D317-A48 | |
| BSA stock | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-110-803 | |
| Collagen type I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | |
| Collagenase II | Gibco, Waltham, MA, USA | 17101-015 | |
| Endothelial cells growth medium | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA | 211-500 | |
| FcR blocking reagent, mouse | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-575 | |
| FlowJo software, version 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Hardened Fine scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14091-11 | |
| Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. | customized; made in house | ||
| Hitachi S 4700 scanning electron microscope | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA | SEM096 | |
| LS columns | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| MACS pre-separation filters (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-823 | |
| MACS rinsing buffer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μm) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | 130-098-462 | |
| MACSQunt flow cytometer | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany | ||
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma, Burlington, MA, USA | PITP01250 | |
| Nexcelom cell counter | Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA | Cellometer Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, USA | 17-0891-01 | |
| Surgical scissors | F.S.T, Foster city, CA, USA | 14001-12 | |
| Very small curved dressing forceps | F.S.T, Foster city, CA, USA | 11063-07 |
References
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
- Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
- Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
- Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells – gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
- DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
- Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. 생물학. 9 (11), 395 (2020).
- Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
- Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).
- Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
- Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
- Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
- Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599 (2013).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284 (2021).
- DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
- DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649 (2019).
- Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
- Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
- Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
- Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
- Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
- Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060 (2015).
- Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
- Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
- Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
- Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356 (2017).
- Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).
