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Abstract
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의학

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Published: December 17, 2021
doi:
10.3791/63064
, , ,
1Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Research Center,University of Alabama at Birmingham (UAB), 2Department of Pediatrics, Division of Pulmonary and Sleep Medicine,UAB

Summary

Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.

Abstract

A terapia individualizada para pacientes com fibrose cística (CF) pode ser alcançada com um modelo de doença in vitro para entender a atividade e restauração do Regulador de Condutância de Fibrose Cística De base (CFTR) atividade e restauração de compostos de pequenas moléculas. Nosso grupo recentemente se concentrou em estabelecer um modelo organoide bem diferenciado diretamente derivado das células epiteliais nasais primárias (HNE). A histologia de organoides seccionados, coloração imunofluorescente de montagem total e imagem (utilizando microscopia confocal, microscopia imunofluorescente e campo brilhante) são essenciais para caracterizar organoides e confirmar a diferenciação epitelial na preparação para ensaios funcionais. Além disso, os organoides HNE produzem lúmens de tamanhos variados que se correlacionam com a atividade do CFTR, distinguindo entre organoides CF e não-CF. Neste manuscrito, a metodologia para a cultura de organoides de HNE é descrita em detalhes, com foco na avaliação da diferenciação utilizando as modalidades de imagem, incluindo a medição da área de lúmen de linha de base (método de medição da atividade cftr em organoides que qualquer laboratório com microscópio pode empregar) bem como a abordagem automatizada desenvolvida para um ensaio funcional (que requer equipamentos mais especializados).

Introduction

Introdução à técnica
Os ensaios ex-vivos baseados na cultura são uma ferramenta cada vez mais utilizada para a medicina de precisão e o estudo da fisiopatologia da doença. A cultura celular epitelial humana primária (HNE) tem sido utilizada em inúmeros estudos de fibrose cística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , uma doença recessiva autossômica que afeta a função celular epitelial em múltiplos órgãos. A cultura HNE fornece uma fonte renovável de epitélia das vias aéreas que pode ser obtida prospectivamente e recapitula qualidades eletrofísicas e bioquímicas para testar a atividade do Regulador de Condutância Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR). As células HNE podem ser amostradas com efeitos colaterais mínimos14, semelhantes aos cotonetes respiratórios virais comuns. Um trabalho de pesquisa descrevendo um modelo para estudo de fibrose cística derivado de biópsias de escova de HNE foi publicado recentemente11,13. Enquanto semelhante a outros modelos que utilizam hneprimário 2,3 e tecido intestinal 15,16,17,18,19, caracterização detalhada da diferenciação e imagem deste modelo são descritos aqui para uso em pesquisa cf e para auxiliar nos estudos de outras doenças das vias aéreas13 . O modelo organoide não é ilimitado como linhas celulares imortalizadas, mas pode ser expandido por reprogramação condicional (usando fibroblastos alimentadores irradiados e inativados e inibidores de Rho-kinase) para um estado mais parecido com células-tronco 20,21,22,23. O processamento de biópsias de escova de HNE usando este método produz um grande número de células epiteliais para uso em múltiplas aplicações a maior rendimento, mantendo ainda a capacidade de diferenciar totalmente. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido usando células alimentadoras, outras metodologias podem ser usadas por pesquisadores que desejam evitar a tecnologia de célulasalimentadoras 14,24.

Importância da técnica para a biologia pulmonar
Um estudo significativo tem sido dedicado a entender como a ausência de CFTR regular e funcional na membrana celular das células epiteliais resulta em disfunção nos pulmões, pâncreas, fígado, intestino ou outros tecidos. O transporte de íons epiteliais disfuncionais, particularmente o de cloreto e bicarbonato, resulta em um volume reduzido dos fluidos de revestimento epitelial e mudanças nas secreções mucosas, levando à estase mucosa e obstrução. Em outras doenças das vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária, o movimento ciliar alterado prejudica o desembaraço mucociliar e leva à mucosa estase e obstrução25. Portanto, o atual modelo organoide do HNE foi desenvolvido para várias aplicações, dependendo do projeto experimental e recursos do pesquisador. Isso inclui imagens de células vivas usando manchas de células vivas; fixação e secção para caracterizar a morfologia; coloração de imunofluorescência com anticorpos e imagens confocal de montagem inteira para evitar a interrupção das estruturas intraluminais; e imagem de campo brilhante e tomografia de coerência micro-óptica para medições quantitativas de frequência de batida ciliar e transporte mucociliary13. Para facilitar a expansão para outros investigadores, foram utilizados reagentes e suprimentos disponíveis comercialmente para cultivo. Foi desenvolvido um ensaio funcional que utilizou técnicas comuns de microscópio e equipamentos mais especializados. No geral, enquanto o modelo atual foi projetado para avaliar a atividade do CFTR na linha de base ou em resposta à terapêutica, as técnicas descritas neste protocolo podem ser aplicadas a outras doenças que envolvam função celular epitelial, especialmente o transporte de fluidos celulares epiteliais.

Comparação com outras metodologias
Recentemente, a utilidade deste modelo organoide foi desenvolvida correlacionando respostas moduladoras in vitro CFTR dos organoides dos pacientes com sua resposta clínica11. Notavelmente, também é demonstrado que o modelo atual paralelamente às respostas de corrente de curto-circuito, o padrão-ouro atual para avaliar a função CFTR, nos mesmos pacientes. A corrente de curto-circuito difere do ensaio de inchaço porque o primeiro mede a função CFTR via transporte deíons 26. Em contrapartida, este ensaio mede um efeito mais a jusante com o transporte de fluidos, fornecendo informações adicionais sobre a função global da CFTR 27,28,29,30,31,32. As medições de corrente de curto-circuito continuaram a ser um método comum e confiável para determinar a atividadedo canal de cloreto de CFTR 1,33. Esses ensaios eletrofisiológicos exigem equipamentos especializados e caros, requerem muitas vezes mais células para cada replicação experimental do que o ensaio organoide, não podem ser facilmente automatizados, e não são capazes de escalar para aplicações de maior rendimento. Outro modelo organoide derivado da epitélia intestinal tem vantagens adicionais 15,16,17,18, como uma excelente capacidade replicativa, mas não é derivado de um tecido das vias aéreas nem está universalmente disponível. As escovações de HNE são obtidas com escovas de citologia baratas sem a necessidade de sedação e com risco mínimo. A escovação não requer um médico e pode ser realizada por coordenadores de pesquisa treinados e outras equipesde pesquisa 14. O modelo organoide do HNE pode ser cultivado por qualquer laboratório com capacidades primárias de cultura celular, e algumas das aplicações podem ser realizadas com técnicas padrão de microscopia. Ao todo, essas vantagens fornecem acesso adicional à tecnologia para avaliação da função epitelial das vias aéreas que, de outra forma, poderiam estar indisponíveis para alguns laboratórios. Além disso, os organoides de HNE podem ser utilizados para estudar outros estados da doença que afetam as vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária25 ou infecção viral, que os organoides intestinais não podem.

Protocol

Amostras de HNE foram coletadas no hospital Infantil do Alabama. Todos os procedimentos e métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade IRB do Alabama em Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar a expansão e melhorar a função das células epiteliais nasais humanas (HNEs), os métodos atuais de cultivo são adaptados do conhecido método de cultura de interface ar-líquido (ALI) 28,34. As HNEs foram inicialmente coletadas por biópsia de esco…

Representative Results

A expansão dos HNEs é essencial para uma cultura organoide próspera. Os HNEs de uma coleção de amostras bem sucedida devem expandir-se para mais de 70% de confluência em torno de 10 dias. Um exemplo de amostras bem sucedidas e mal sucedidas é mostrado na Figura 1A e Figura 1B, respectivamente. As células devem ser descartadas se não puderem atingir 70% de confluência até 14 dias após a cocultura com células 3T3 irradiadas. Quaisquer…

Discussion

Este manuscrito fornece metodologias detalhadas para imagens abrangentes ao vivo e fixas dos organoides epiteliais das vias aéreas derivados da biópsia da escova HNE. Descreve ensaios funcionais que podem determinar a atividade do CFTR em um indivíduo. Os HNEs fornecem um tecido primário minimamente invasivo para uma variedade de aplicações. As técnicas de expansão aqui oferecidas podem ser utilizadas para modelar doenças das vias aéreas, incluindo organoides. Organoides podem ser usados para abordagens terapê…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos as contribuições de todos os participantes que doaram biópsias de escovas de HNE para desenvolver este protocolo. Agradecemos à latona Kersh e à equipe da Unidade de Pesquisa Infantil por coordenar o recrutamento voluntário de estudos e coleções de amostras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey e Stephen Mackay, ex-estagiários do laboratório, por assistência técnica. Agradecemos a Zhong Liu e Rui Zhao por sua ajuda técnica. Steven M. Rowe, diretor do Centro de Pesquisa cf da UAB, fornece liderança e recursos, sem os quais este trabalho não seria possível. Também gostaríamos de agradecer a Sarah Guadiana da Biotek pela assistência com o treinamento de instrumentos, Robert Grabski pela assistência de microscopia confocal no Centro de Imagem de Alta Resolução da UAB, e Dezhi Wang por assistência histológica no Núcleo de Histologia da UAB. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH.) Grant K23HL143167 (para JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (para JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 e DK072482 e o CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], e o UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

Materials

Nasal brush Medical Packaging CYB1 CYB-1 Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette Tips ThermoFisher Scientific 02-707-141 Large bore pipette tips
Accutase ThermoFisher Scientific A1110501 Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTA Gibco 25300-054
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrix Corning 356255 Extracellular matrix (EM)
µ-Slide Angiogenesis Ibidi 81506 15-well slide
24-Well Transwell Corning 7200154 Culture insert
Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155409 8-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific 354240 Cell adhesive
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 50980487
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
BSA ThermoFisher Scientific BP1600-100
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) Nikon Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25 Nikon Confocal microscope
NIS Elements- Basic Research Nikon manual imaging analysis software
Histogel ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Disposable Base Molds ThermoFisher Scientific 41-740
Lionheart FX BioTek BTLFX Automated image system
Lionheart Cover BioTek BT1450009 Environmental Control Lid
Humidity Chamber BioTek BT1450006 Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2 BioTek BT1210013 Gas controller
Microplate/Slide Stage Insert BioTek BT1450527 Slide holder
Gen5 Imaging Prime Software BioTek BTGEN5IPRIM Automated imaging analysis software
4x Phase Contrast Objective BioTek BT1320515
10x Phase Contrast Objective BioTek BT1320516
LED Cube BioTek BT1225007
Filter Cube (DAPI) BioTek BT1225100 DAPI
CFTRinh-172 Selleck Chemicals S7139
Forskolin Sigma F6886
IBMX Sigma I5879
Expansion Media
DMEM ThermoFisher Scientific 11965
F12 Nutrient mix ThermoFisher Scientific 11765
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific  16140-071
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific  15-140-122
Cholera Toxin Sigma  C8052
Epidermal Growth Factor (EGF) ThermoFisher Scientific  PHG0314
Hydrocortisone (HC) Sigma  H0888
Insulin Sigma  I9278
Adenine Sigma  A2786
Y-27632 Stemgent  04-0012-02
Antibiotic Media
Ceftazidime Alfa Aesar  J66460-03
Tobramycin Alfa Aesar  J67340
Vancomycin Alfa Aesar  J67251
Amphotericin B Sigma  A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1) ThermoFisher Scientific  11330-32
Ultroser-G Pall  15950-017
Fetal Clone II Hyclone  SH30066.03
Bovine Brain Extract Lonza  CC-4098
Insulin Sigma  I-9278
Hydrocortisone Sigma  H-0888
Triiodothyronine Sigma  T-6397
Transferrin Sigma  T-0665
Ethanolamine Sigma  E-0135
Epinephrine Sigma E-4250
O-Phosphorylethanolamine Sigma P-0503
Retinoic Acid Sigma R-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibody R&D Systems MAB1660 Dilution: 100x
ZO-1 antibody Thermo Fisher MA3-39100-A647 Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibody Sigma HPA008246 Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulin Sigma T7451 Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibody Abcam Ab11315 Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Invitrogen A21207 Dilution: 2000x
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References

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Liu, Z., Anderson, J. D., Natt, J., Guimbellot, J. S. Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids. J. Vis. Exp. (178), e63064, doi:10.3791/63064 (2021).
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