Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto
Summary
Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.
Abstract
Los experimentos de proteómica de escopeta basados en espectrometría de masas requieren múltiples pasos de preparación de muestras, incluida la digestión enzimática de proteínas y la limpieza, que pueden ocupar horas-persona significativas de trabajo de banco y presentar una fuente de variabilidad de lote a lote. La automatización de laboratorio con robots pipeteadores puede reducir el trabajo manual, maximizar el rendimiento y aumentar la reproducibilidad de la investigación. Aún así, los altos precios iniciales de las estaciones de automatización estándar las hacen inasequibles para muchos laboratorios académicos. Este artículo describe un flujo de trabajo de preparación de muestras de proteómica utilizando un sistema de automatización de código abierto asequible (The Opentrons OT-2), que incluye instrucciones para configurar pasos semiautomatizados de reducción de proteínas, alquilación, digestión y limpieza; así como acompañar scripts Python de código abierto para programar el sistema OT-2 a través de su interfaz de programación de aplicaciones.
Introduction
La proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa para medir la abundancia de muchas proteínas en muestras biológicas simultáneamente. Los experimentos de proteómica con análisis bioinformático se emplean rutinariamente para identificar biomarcadores y descubrir complejos biológicos asociados y vías que sustentan los mecanismos patológicos. Con su alta especificidad de analito y su potencial precisión cuantitativa, la proteómica de escopeta también tiene un excelente potencial para ser adoptada por instalaciones de investigación y laboratorios de diagnóstico para el análisis de muestras clínicas sin la necesidad de depender de anticuerpos1,2.
Para preparar muestras de proteínas para el análisis proteómico de escopeta, las proteínas extraídas de muestras biológicas (por ejemplo, células y tejidos) generalmente primero deben procesarse utilizando protocolos largos, incluida la medición de la concentración de proteínas de la muestra, la reducción y alquilación de proteínas, y la digestión enzimática en péptidos. Además, las proteínas extraídas en tampones de lisis comunes que contienen detergentes a menudo requieren pasos adicionales de intercambio de tampón o eliminación de detergente antes del análisis porque el detergente puede interferir con la digestión de tripsina y degradar significativamente el rendimiento del análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) aguas abajo3. Los péptidos generalmente se desalan, se secan y reconstituyen en disolventes compatibles con LC-MS / MS después de la digestión enzimática. Estos procedimientos de bioquímica de proteínas pueden ser laboriosos y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, continúan limitando el rendimiento de los flujos de trabajo de proteómica y contribuyen a la variabilidad de los datos adquiridos4,5. Los errores y sesgos humanos han sido reconocidos como factores cruciales que afectan la varianza y reproducibilidad de los datos6,7. Para minimizar los errores humanos en los flujos de trabajo de preparación de muestras de espectrometría de masas, se han utilizado sistemas robóticos de pipeteo automatizados para mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de proteínas a partir de la proteómica de escopeta y el análisis de espectrometría de masas dirigida, donde tales avances han sido aclamados como instrumentales para continuar el impulso de la adopción generalizada de tecnologías proteómicas en entornos clínicos y de investigación críticos8, 9,10,11,12,13. Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes utilizan plataformas robóticas de manejo de líquidos que requieren una inversión y capacitación sustanciales, lo que limita su utilidad en muchos laboratorios en el entorno académico o con un presupuesto limitado.
Este artículo describe un protocolo que utiliza un sistema robótico de manejo de líquidos de bajo costo y código abierto, el OT-2, para semiautomatizar un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta. El OT-2 tiene un costo más bajo que muchos otros sistemas robóticos de manejo de líquidos, y en el momento de escribir este artículo, cuesta aproximadamente $ 5,000 dólares estadounidenses. Al tener en cuenta los precios de diferentes módulos y artículos de laboratorio, el costo total para establecer experimentos en este protocolo en el momento de escribir este artículo es de alrededor de $ 10,000, lo que lo hace más asequible para un conjunto considerablemente más amplio de laboratorios sobre opciones más caras. El OT-2 es compatible con la programación de código abierto a través de scripts Python y ofrece grandes flexibilidades en el diseño de protocolos de bricolaje definidos por el usuario. Utilizando tres scripts desarrollados internamente, los protocolos a continuación cubren la ejecución de un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta en la estación OT-2 con un estándar de proteína arquetípico (albúmina sérica bovina; BSA) y una muestra de proteína compleja de un lisado normal del corazón humano (Figura 1). Los procedimientos para procesar (1) una muestra de BSA y (2) una muestra de lisado cardíaco complejo se detallan en las secciones 1, 2, 5, 6 y 3, 4, 5, 6 del Protocolo, respectivamente. Las perlas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag se utilizan en la preparación de muestras mejoradas en fase sólida (SP3) de una sola olla para eliminar detergentes y sales en las muestras de proteínas y péptidos. Los resúmenes trípticos de la albúmina sérica bovina y las proteínas del corazón humano se limpian aún más con perlas SP3 y se envían para el análisis LC-MS / MS. Los espectros de masas se analizan utilizando el software MaxQuant para la identificación de péptidos y proteínas. Los resultados representativos realizados por nosotros muestran que el protocolo logra excelentes coeficientes técnicos de variación (CV) al tiempo que ahorra tiempo de banco y no es inferior al digesto manual.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo
Para obtener el mejor rendimiento, se deben utilizar utensilios de laboratorio, módulos y consumibles verificados por Opentrons compatibles con OT-2. Se puede crear material de laboratorio personalizado siguiendo las instrucciones de Opentrons en Reference14. Asegúrese de calibrar la cubierta OT-2, las pipetas y el material de laboratorio cuando se use por primera vez. También es fundamental seguir las pautas del fabricante de perlas SP3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los premios nih F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 se crean con la ayuda de una herramienta de ilustración científica basada en la web, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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