Summary

オープンソースのラボロボットによるショットガンプロテオミクスサンプル処理

Published: October 28, 2021
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Summary

オープンソースのロボット液体処理システムを操作して、半自動タンパク質サンプル調製を行い、洗剤の除去、タンパク質消化、ペプチド脱塩のステップをカバーするための詳細なプロトコルと3つのPythonスクリプトが提供されています。

Abstract

質量分析ベースの散弾銃プロテオミクス実験では、酵素タンパク質消化やクリーンアップなど、複数のサンプル調製ステップが必要であり、ベンチ労働の時間を要し、バッチ間の変動の原因を提示することができます。ピペットロボットによるラボの自動化により、手作業を削減し、スループットを最大化し、研究の再現性を向上させることができます。それでも、標準的なオートメーションステーションの急激な開始価格は、多くの学術研究所にとって手頃な価格ではありません。この記事では、半自動タンパク質還元、アルキル化、消化、およびクリーンアップ手順を設定するための指示を含む、手頃な価格のオープンソースオートメーションシステム(Opentrons OT-2)を使用したプロテオミクスサンプル調製ワークフローについて説明します。OT-2システムをアプリケーションプログラミングインタフェースでプログラミングするためのオープンソースのPythonスクリプトを伴います。

Introduction

質量分析ベースの散弾銃プロテオミクスは、生物学的サンプル中の多くのタンパク質の存在量を同時に測定する強力なツールです。バイオインフォマティクス解析を用いたプロテオミクス実験は、バイオマーカーを同定し、病理学的メカニズムを支える関連する生物学的複合体および経路を発見するために日常的に使用されています。高い分析物特異性と潜在的な定量精度により、ショットガンプロテオミクスは、抗体に頼ることなく臨床サンプル分析のための研究施設や診断ラボで採用される優れた可能性を秘めています1,2

ショットガンプロテオミクス分析用のタンパク質サンプルを調製するには、通常、生体サンプルから抽出したタンパク質(細胞や組織)は、サンプルタンパク質濃度の測定、タンパク質還元、アルキル化、ペプチドへの酵素消化など、長いプロトコルを使用して処理する必要があります。さらに、洗剤を含む一般的な溶解バッファーで抽出されたタンパク質は、多くの場合、分析の前にバッファー交換または洗剤除去の追加のステップを必要とするため、洗剤はトリプシン消化を妨げ、下流の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析の性能を著しく低下させる可能性があります3.ペプチドは、典型的には、さらに脱塩、乾燥、および酵素消化に続くLC-MS/MS適合溶媒で再構成される。これらのタンパク質の生化学手順は、労働集約的で時間がかかる場合があります。したがって、彼らはプロテオミクスワークフローのスループットを制限し続け、取得したデータ4,5の変動に貢献します。人為的ミスとバイアスは、データの分散と再現性に影響を与える重要な要因として認識されてきました 6,7.質量分析サンプル調製ワークフローにおける人為的ミスを最小限に抑えるために、自動ピペットロボットシステムは、ショットガンプロテオミクスおよび標的質量分析によるタンパク質同定と定量のスループットと再現性を向上させるために利用され、そのような進歩は重要な研究および臨床現場でのプロテオミクス技術の普及を続けるためのインストゥルメンタルとして賞賛されている8 9,10,11,12,13.しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、多額の投資とトレーニングを必要とするロボット液体処理プラットフォームを利用しており、学術環境の多くの研究室での有用性を制限したり、予算が限られているりします。

この記事では、低コストのオープンソースのロボット液体処理システムOT-2を利用して、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを半自動化するプロトコルについて説明します。OT-2は他の多くのロボット液体ハンドリングシステムよりも低コストで、執筆時点では約5,000米ドルの費用がかかります。異なるモジュールやラボウェアの価格を考慮すると、執筆時点でこのプロトコルで実験を設定するための総コストは約$ 10,000であり、より高価なオプションよりもかなり広範なラボセットに手頃な価格になります。OT-2はPythonスクリプトを通したオープンソースプログラミングと互換性があり、ユーザー定義のDIYプロトコル設計に大きな柔軟性を提供します。3つの社内開発スクリプトを使用して、以下のプロトコルは、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを、典型的なタンパク質標準(ウシ血清アルブミン)でOT-2ステーションで実行することをカバーしています。BSA)と正常なヒト心臓のタンパク質サンプルをライセート(図1)とした。(1)BSAサンプルおよび(2)複雑な心臓ライセートサンプルを処理する手順は、それぞれプロトコルセクション1、2、5、6および4、5、6で詳述されている。Sera-Magカルボキシレート変性磁気ビーズは、タンパク質およびペプチドサンプル中の洗剤および塩を除去するために、単一ポット固相強化サンプル調製(SP3)で利用されます。ウシ血清アルブミンおよびヒト心臓タンパク質からのトリプティック消化は、SP3ビーズによってさらに洗浄され、LC-MS/MS分析のために提出される。質量スペクトルは、ペプチドおよびタンパク質同定のためのMaxQuantソフトウェアを使用して分析されます。我々が行う代表的な結果は、プロトコルがベンチ時間を節約しながら、変動の優れた技術的係数(CV)を達成し、手の消化に劣り、示しています。

Protocol

開発された Python スクリプトは GitHub に入金されました: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。スクリプトのコピーは 、補足ファイル 1 に記載されています。最新バージョンについては、GitHub リポジトリを参照してください。 1. 実験準備 プロトコルを開始する前に、必要なハードウェアを確認してください。注:次のハードウ?…

Representative Results

OT-2ロボットと互換性があり、単一のタンパク質標準ウシ血清アルブミン(技術的複製n = 5消化)と洗剤含有ヒト心臓ライセートサンプル(n = 5消化)を用いた質量分析プロテオミクスのサンプル調製を行う3つのPythonスクリプトが提供されています。各消化産物は、2つのペプチドのクリーンアップ反応に分割されます。BSAおよび心臓サンプルの各ランにおける同定されたペプチドスペクトルマッチ(P…

Discussion

プロトコル内の重要なステップ
最高のパフォーマンスを得るため、OT-2と互換性のあるOpentrons検証済みのラボウェア、モジュール、および消耗品を使用する必要があります。カスタムラボウェアは、Reference14でのOpentronsの指示に従って作成できます。OT-2デッキ、ピペット、ラボウェアを初めて使用する場合は必ず調整してください。また、ペプチドおよびタン…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、YHに対するNIH賞F32-HL149191によって部分的にサポートされました。R00-HL144829 から EL;R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 to MPL. 図1図2図3 は、ウェブベースの科学イラストレーションツールの助けを借りて作成された、BioRender.com。

Materials

300 µL pipette tips Opentrons
4-in-1 tube rack set Opentrons Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column Thermo Scientific #164568 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm
Acetonitrile LC-MS grade VWR #JT9829
Aluminum block set Opentrons This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.
Ammonium Bicarbonate Sigma-Aldrich # A6141
Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL Thermo Scientific #23210
Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade Thermo Scientific #85190
Dithiothreitol Sigma-Aldrich #D5545
EASY-Spray HPLC Columns Thermo Scientific #ES800A
EasynLC 1200 Nano LC Thermo Scientific #LC140
Ethanol Proof 195-200 Fisher #04-355-720
Formic Acid LC-MS grade Thermo Scientific #85178
Human heart lysate Novus Biologicals NB820-59217
Iodoacetamide Sigma-Aldrich #I1149
Magnetic tube rack Thermo Scientific #MR02
MAXQuant v.1.6.10.43 Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
mySPIN 6 Mini Centrifuge Thermo Scientific #75004061 benchtop mini centrifuge for quick spin
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons
OT-2 magnetic module Opentrons GEN1
OT-2 P300 single channel pipette Opentrons GEN1
OT-2 P50 single channel pipette Opentrons GEN1
OT-2 robot pipetting robot Opentrons OT-2
OT-2 temperature module Opentrons GEN1
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific #23275
Protein LoBind tubes 2.0 mL Eppendorf #022431102
Protein Sequence Database UniProt/SwissProt https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20reviewed:yes
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic Cytiva #65152105050250
Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic Cytiva #45152105050250
SpeedVac Thermo Scientific Vacuum evaporator
Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific #IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Trypsin MS Grade Thermo Scientific #90057
Water LC-MS grade VWR #BDH83645.400

References

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Cite This Article
Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot. J. Vis. Exp. (176), e63092, doi:10.3791/63092 (2021).

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