Method Article

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

DOI:

10.3791/63107

⸱

February 16th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

In This Article

Summary

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여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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생체 내에서 산화질소(NO) 활성은 그의 직접적인 효과, NO autoxidation으로부터 생성된 그의 유도체의 작용, 및 니트로화 화합물의 효과의 조합된 결과이다. NO 대사산물을 측정하는 것은 혈관 수준과 다른 조직, 특히 외인성 NO가 투여되는 실험 환경에서 NO 활성을 연구하는 데 필수적입니다. 오존 기반 화학발광 분석은 유체(플라즈마, 조직 균질물, 세포 배양물 포함) 및 가스 혼합물(예: 내뿜는 호흡) 모두에서 NO 및 NO 대사산물의 정밀한 측정을 가능하게 합니다. NO는 오존과 반응하여 흥분 상태에서 이산화질소를 생성합니다. 결과적으로 발광은 광검출 및 샘플의 NO 함량을 반영하는 전기 신호의 생성을 허용합니다. 동일한 샘플로부터의 분취량은 특정 NO 대사산물, 예컨대 질산염, 아질산염, S-니트로소티올, 및 철-니트로실 착물을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 무세포 헤모글로빈에 의해 소비된 NO는 또한 화학발광 분석으로 정량화된다. 이러한 모든 기술에 대한 그림이 제공됩니다.

Introduction

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살바도르 몬카다와 노벨상 수상자인 로버트 푸르치고트, 루이 이그나로, 페리드 무라드가 산화질소(NO)를 이전에 알려진 내피 유래 이완인자(EDRF)로 확인했기 때문에, NO의 중심 역할은 혈관 생물학, 신경과학, 대사 및 숙주 반응전반에 걸친 몇 가지 주요 메커니즘에서 확립되었다 1,2,3,4,5,6,7 . NO 가스의 외인성 투여는 신생아8에서 폐 고혈압으로 인한 호흡 부전에 대한 확립된 치료법이 되었다. 산화 질소 가스는 또한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염, 말라리아 및 기타 감염성 질환, 허혈 재관류 손상의 치료 및 심장 수술을받는 환자의 급성 신장 손상 예방 9,10,11,12에 대해 조사되었습니다.

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Protocol

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이 프로토콜에 표시된 절차는 매사추세츠 종합 병원의 검토위원회에 따라 결정됩니다. 사용된 혈액 샘플은 이전 연구 동안 수집되었고, 현재의 목적(18)을 위해 비확인되었다.

주: 퍼지 용기, 세척 및 일반 유지 보수를 구성하는 튜브와 유리 제품 간의 최적 연결에 대한 구체적인 지침은 제조업체의 지침을 참조하십시오. 연결은 유리 제품을 손상시키지 않도록 단단하고 신중하게 만들어야합니다. 가스 유입 라인, 가열 재킷 및 응축기가있는 퍼지 용기, 수산화 나트륨 (NaOH) 가스 버블러 트랩, 퍼지 용기와 버블러 사이의 연결 라인, 퍼지 용기 출구 가스 라인 (CLD까지)에는 강렬한 전계 유전체 (IFD) 필터가 부여됩니다. 정화 용기와 CLD의 샘플 입구 사이의 IFD 필터 라인은 액체 형태의 NO 대사 산물 (플라즈마, 세포 배양물, 조직 균질물)이 측정 될 때마다 제자리에 있어야합니다 (프로토콜에 제시된 모든 분석). 샘플 준비는 분석되는 유체 또는 조직 및 관심있는 화합물에 따라 다릅니다. 사전 분석 단계의 중요한 측면은 섹션 1과 2에서 다룹니다. 특정 검정을 위한 특정 준비 단계는 섹션 3-5에 포함된다. 섹션 6-8은 모든 분석에 적용됩니다.

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Results

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무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비는 공지된 농도의 무세포 oxyHb를 함유하는 샘플에서 사용되었다(도 4). 옥시Hb의 하나의 헴이 화학량론적으로 분석에서 하나의 NO 분자를 방출함에 따라, 정제된 무세포 oxyHb는 검정에 대한 검량선을 구축하는데 사용된다(보충 도 3).

심장 수술 중 심폐 우회술(CPB)에서 벗어나는 환자에서 무세포 Hb(비색 분석법으로 측정됨)와 NO 소비 사이의 용량-반응 관계가 도 5에 도시되어 있다. CPB 후 Hb-Fe2+-O2 상태(도 5, 적색)에서 헴 그룹의 농도가 더 높다고 가정할 수 있는데, 이로부터 무세포 Hb의 헴 그룹 중 소수만이 NO를 소비하는 CPB 동안 NO를 투여받은 환자에 비해 (도 5, 적색

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Discussion

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높은 민감도로 인해, NO 및 관련 화합물의 결정을 위한 화학발광 기반 분석은NO2-오염의 위험이 높다. 실험에 사용된 각각의 시약 (특히 NO2-차단 용액) 및 희석제 (ddH2O 포함)는 배경 신호에 대해 보정하기위해 그의NO2-함량에 대해 시험되어야 한다. 아질산염은 10분 전혈에서 반감기가 매우 반응하며NO3-를 빠르게 생성한다. 따라서 혈액 수집과 원심분리 또는NO2-차단 사이에 경과하는 시간은 사전 분석 오류를 일으킬 수 있으므로 최소화해야합니다15. 혈장 샘플을 이용한 분석에서, 바람직하게는 헤파린 튜브에 혈액을 수집하고, 250 mg의 NEM을 10 mL의 인산완충 식염수(PBS)에 용해시킴으로써 생성된 200 nM NEM의 40 μL로 티올기를 봉쇄한 후 4.......

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Disclosures

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L.B.는 용혈 및 산화 질소에 대한 그의 연구에 대한 수석 연구원으로 K23 HL128882 / NHLBI NIH로부터 급여 지원을받습니다. LB는 George Mason University의 Mercatus Center와 iNO Therapeutics LLC의 "COVID-19 연구를위한 빠른 보조금"으로부터 보조금을받습니다. B.Y.는 NHLBI / #R21HL130956 및 DOD / 제네바 재단 (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244)의 보조금으로 지원됩니다. B.Y.는 MGH에서 산화 질소의 전기 생성에 관한 특허를 받았습니다.

L.B.와 B.Y.는 2021년 6월 7일에 출원된 COVID-19 질병 PCT 출원번호: PCT/US2021/036269에서 NO 전달에 대한 특허 출원을 제출했습니다. RWC는 자원이 부족한 환경에 위치한 어린이의 결핵에 대한 분산 진단을 목표로하는 기술 개발의 수석 연구원으로 Unitaid로부터 급여 지원을받습니다.

Acknowledgements

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이 원고에보고 된 프로토콜은 매사추세츠 종합 병원의 마취학과 인 워렌 자폴 (Warren Zapol) 박사의 중환자 치료 마취 연구 연구소의 이전 동료들의 축적 된 기여로 가능했습니다. 우리는 나카가와 아키토 박사, 프란체스코 자덱, 엠마누엘레 바세나, 정 레이, 나가사카 야스코, 에스테르 스파그놀리, 엠마누엘레 레조아글리 박사의 공헌을 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세트산Sigma45754500 mL - 액체
소포제 B 에멀젼SigmaA5757250 mL - 액체
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x) 칼슘 없음, 마그네슘 없음ThermoFisher14190144500 mL
염산 37% (1 M)Sigma258148500 mL - 액체
요오드SAFC207772100 g - 고체
KimwipesKimtech34155
수은 (II) 염화물 ACS 시약> 99.5%Sigma215465100 g - 고체 (물에 용해)
Mili-Q 정수 시스템Millipore
모델 705 RN 50 μ L 주사기Hamilton80530마이크로리터 주사기
모델 802 N 25 μ L 주사기Hamilton84854마이크로리터 주사기
N-ethylmaleimideSigma426025 g - 결정질
질산화물 분석기 + 번들 소프트웨어 - 퍼지 용기ZysenseNOA 280i화학발광 검출기
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS 시약; 99%Sigma244023100 g - 분말
Potassium Iodide ACS 시약> 99%Sigma221945100 g - 고체
Potassium Nitrite cryst. 분석용 EMSURE ACSSupelco105067250g - 결정질
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251기계식 균질화기
RV3 2단 로터리 베인 펌프EdwardsA65201906진공 펌프 - 분석기와 함께 번들
파린 나트륨 - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 USP 단위
산화나트륨 무수 ACS 시약 &지; 97 %Sigma7954291 kg - 펠릿
질산 나트륨 ACS 시약 ≥ 99 %Sigma221341500 g - 분말
아질산 나트륨 ≥ 99 %SigmaS2252500 g - 결정질
설파 닐 아미드 ≥ 98 %SigmaS9251100 g - 고체
바나듐 (III) 염화물시그마11239325 g - 고체 -주의 (발열성)
Whatman 1 여과지시그마WHA10010155
헤 수

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F.

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