Quantificazione del potenziale impatto dei prodotti a base di glifosato sui microbiomi

Summary

I prodotti a base di glifosato (GBP) sono gli erbicidi ad ampio spettro più comuni in tutto il mondo. In questo articolo, introduciamo linee guida generali per quantificare l’effetto della GBP sui microbiomi, dagli esperimenti sul campo alle analisi bioinformatiche.

Abstract

I prodotti a base di glifosato (GBP) sono gli erbicidi ad ampio spettro più comuni in tutto il mondo. Il bersaglio del glifosato è l’enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) nella via shikimate, che è praticamente universale nelle piante. L’inibizione dell’enzima interrompe la produzione di tre aminoacidi essenziali: fenilalanina, tirosina e triptofano. L’EPSPS è presente anche in funghi e procarioti, come archaea e batteri; pertanto, l’uso di GBP può avere un impatto sulla composizione del microbioma di suoli, piante, erbivori e consumatori secondari. Questo articolo mira a presentare linee guida generali per valutare l’effetto della GBP sui microbiomi dagli esperimenti sul campo alle analisi bioinformatiche e fornire alcune ipotesi verificabili. Vengono presentati due esperimenti sul campo per testare la GBP su organismi non bersaglio. In primo luogo, i microbi associati alle piante provenienti da 10 grafici di controllo replicati e di trattamento GBP che simulano il raccolto no-till vengono campionati e analizzati. Nel secondo esperimento sono stati ottenuti campioni da appezzamenti sperimentali fecondati da letame di pollame contenente residui di glifosato o letame di controllo non trattato. L’analisi bioinformatica delle sequenze proteiche EPSPS viene utilizzata per determinare la potenziale sensibilità dei microbi al glifosato. Il primo passo per stimare l’effetto della GBP sui microbiomi è determinare la loro potenziale sensibilità all’enzima bersaglio (EPSPS). Le sequenze microbiche possono essere ottenute sia da archivi pubblici che mediante amplificazione PCR. Tuttavia, nella maggior parte degli studi sul campo, la composizione del microbioma è stata determinata sulla base di marcatori universali del DNA come l’rRNA 16S e il distanziatore trascritto interno (ITS). In questi casi, la sensibilità al glifosato può essere stimata solo attraverso un’analisi probabilistica delle sequenze EPSPS utilizzando specie strettamente correlate. La quantificazione della potenziale sensibilità degli organismi al glifosato, basata sull’enzima EPSPS, fornisce un approccio robusto per ulteriori esperimenti per studiare meccanismi di resistenza bersaglio e non bersaglio.

Introduction

L’uso massiccio di pesticidi nell’agricoltura moderna è chiaramente un importante contributo al declino della biodiversità¹. Questo documento si concentra sul glifosato perché i prodotti a base di glifosato (GBP) sono diventati i pesticidi più utilizzati a livello globale grazie alla loro efficienza e al prezzo accessibile ^2,3. Oltre a uccidere le erbacce nei campi agricoli, i GBP sono comunemente usati in silvicoltura, ambienti urbani e giardini domestici; inoltre, sono stati proclamati come non tossici per gli organismi non bersaglio se utilizzati in conformità con le istruzioni del fabbricante. Tuttavia, un numero crescente di studi recenti ha rivelato che i residui di glifosato e dei suoi prodotti di degradazione possono essere trattenuti e trasportati nei suoli, avendo così effetti a cascata su organismi non bersaglio 4,5,6,7,8 . Gli effetti del glifosato non sono limitati solo alle piante: la via dello shikimate è presente anche in molti funghi e procarioti. Il glifosato prende di mira l’enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) nella via dello shikimate, noto anche come aroA⁹. Questo enzima è al centro della via shikimate nella sintesi dei tre aminoacidi aromatici essenziali (fenilalanina, tirosina e triptofano), ed è presente nella maggior parte dei procarioti, piante e funghi^10,11. Alcune specie microbiche hanno sviluppato una resistenza parziale o assoluta al glifosato per mezzo di diversi meccanismi, tra cui mutazioni nelle sequenze EPSPS. Pertanto, è stato suggerito che l’uso di GBP possa avere un effetto diretto sui microbiomi vegetali e animali, incluso il microbioma intestinale umano 12,13,14. Tuttavia, l’uso della GBP può avere un impatto negativo praticamente su qualsiasi funzione e servizio ecosistemico basato su microbi e processi facilitati dai microbi. Le minacce conseguenti possono riguardare i processi biochimici del suolo, la biologia dell’impollinazione e il benessere animale e umano. Ciò richiede una comprensione più completa di come il glifosato influisce sui percorsi e sui metodi dello shikimate per valutare la sensibilità dei microbi al glifosato.

In questo protocollo, presentiamo una pipeline per testare l’effetto del glifosato e della GBP sul microbioma, dagli esperimenti sul campo alle analisi bioinformatiche. Descriviamo in dettaglio un metodo bioinformatico recentemente pubblicato che può essere utilizzato per determinare la potenziale sensibilità degli organismi al glifosato¹². Per quanto a conoscenza dei ricercatori, questo è il primo e finora, l’unico strumento bioinformatico per valutare la sensibilità intrinseca dell’enzima EPSPS al componente attivo delle GBP. Questo metodo bioinformatico si basa sulla rilevazione di marcatori di aminoacidi noti nell’enzima bersaglio del glifosato (EPSPS)¹². La pipeline è divisa in cinque fasi di lavoro principali (Figura 1): 1) una breve introduzione a due esperimenti sul campo per testare l’effetto dei GBP, 2) un breve riassunto delle analisi del microbioma (16S rRNA, ITS e gene EPSPS ), 3) raccolta di sequenze EPSPS da repository pubblici, 4) determinazione della potenziale sensibilità degli organismi al glifosato e 5) valutazione della classe EPSPS da marcatori microbici universali (16S rRNA e ITS).

Protocol

1. Due esperimenti sul campo per testare l’effetto dei GBP NOTA: questo protocollo presenta due esempi di progetti sperimentali sul campo per testare l’effetto dei GBP sui microbi associati alle piante. Entrambi gli esperimenti sono stati condotti in campi messi a riposo senza precedenti di erbicidi o usi agricoli presso l’Università di Turku Ruissalo Botanical Garden in Finlandia (60º26’N, 22º10’E). Il terreno è argilloso sabbioso con un’alta percentuale di materia organica. Esperimento 1NOTA: Questo esperimento è stato progettato per simulare le pratiche agricole generali dell’agricoltura no-till con applicazioni GBP prima e dopo la stagione di crescita per combattere le erbe infestanti. Dividere il campo sperimentale in 10 grafici di controllo replicati e di trattamento GBP (23 m x 1,5 m) con fasce tampone di vegetazione tra i terreni (in questo studio nella primavera 201415) (Figura 2). Assicurarsi che le trame siano lavorate con una fresatrice ad una profondità di 5 cm e trattate due volte l’anno. Qui, le trame sono state trattate all’inizio (maggio) e alla fine (ottobre) della stagione di crescita. Trattare le parcelle di controllo con acqua di rubinetto (5 L/piazzola) e le parcelle GBP con GBP commerciali (concentrazione di glifosato 450 g· L-1, tasso di applicazione 6,4 L·ha-1 in 5 L di acqua di rubinetto per appezzamento) per imitare il dosaggio massimo consentito di glifosato nelle pratiche agricole (3 kg·ha-1). Applicare i trattamenti con un serbatoio a pressione azionato a mano che ha uno spruzzatore manuale. Due settimane dopo l’applicazione GBP, seminare avena (Avena sativa), fave (Vicia faba), colza di rape (Brassica rapa subsp. oleifera) e patate vegetali (Solanum tuberosum) negli appezzamenti secondo le pratiche agricole. Durante la stagione di crescita, diserbare a mano le trame per mantenere la concorrenza delle piante e la struttura del suolo il più simili possibile nelle trame di controllo e trattate con GBP. Campionare il microbiota da piante sperimentali. In questo studio, il microbiota è stato campionato consecutivamente dal 2017 al 2020 in entrambi i terreni di trattamento trattati con GBP e di controllo una volta per stagione di crescita nel corso dello studio. Raccogliere dieci repliche dei campioni vegetali (radice e foglia) dal campo, metterle immediatamente sul ghiaccio e portarle in laboratorio per un’ulteriore elaborazione, come descritto nella sezione 2.1. Esperimento 2NOTA: questo esperimento è stato progettato per testare i rischi associati all’economia alimentare circolare; più precisamente, è stato concepito per esaminare le conseguenze dei residui di GBP nel letame applicato come fertilizzante alle piantecoltivate 2 (figura 3). Raccogli lettiere, tra cui trucioli di legno, feci e alcuni mangimi versati, da quaglie alimentate con mangimi contaminati da GBP o di controllo in un esperimento di voliera di 12 mesi16,17.NOTA: Il mangime contaminato da GBP consisteva in mangimi biologici per la deposizione di polli combinati con un equivalente di 160 mg di glifosato / kg, che corrisponde a un’assunzione giornaliera di 12-20 mg di glifosato per chilogrammo di massa corporea nelle quaglie giapponesi adulte 16,17. Per la convalida, inviare i campioni a un laboratorio accreditato per le misurazioni della concentrazione di glifosato in sei lotti di mangime. Inoltre, misurare i residui di glifosato in campioni di escrementi di quaglia dopo 12 mesi di esposizione. Il gruppo di controllo è stato alimentato con lo stesso mangime organico senza aggiunta di GBP16,17. Durante l’esperimento di voliera, cambia le lenzuola due volte alla settimana. Raccogliere regolarmente le lettiere usate da 8-12 mesi di esposizione dal trattamento e dai controlli GBP, piscina per trattamento e conservare in contenitori chiusi in un magazzino asciutto e buio a 6 ° C prima di utilizzarlo come fertilizzante. Distribuisci manualmente 12 L dei letti su ciascuno dei 18 grafici di controllo da 18 GBP e 18 (dimensioni 1 m x 1 m) in una griglia a scacchiera 6 x 6 nel campo sperimentale in due punti temporali. In questo studio, i letti sono stati distribuiti nell’agosto 2018 e nel maggio 2019. Invia i campioni di lettiera a un laboratorio accreditato per le misurazioni della concentrazione di glifosato direttamente dopo la diffusione (in questo studio a maggio 2019). Pianta piante perenni di erba e fragola in ogni trama per studiare il loro microbiota radicale e fogliare.NOTA: In questo studio quattro piante erbacee perenni (Festuca pratensis) e due piante di fragole (Fragaria x vescana) sono state piantate per ogni appezzamento e studiate per il loro microbiota radicale e fogliare. 2. Analisi del microbioma (16S rRNA, ITS e gene EPSPS ) NOTA: La maggior parte degli studi sul microbioma si basa sull’analisi del gene rRNA 16S per le regioni batteriche e interne trascritte spacer (ITS) per le comunità fungine utilizzando tecnologie di sequenziamento di prossima generazione. Pertanto, il documento non ha informazioni sul tipo di EPSPS. Le sequenze EPSPS di migliaia di specie sono disponibili in archivi pubblici (sezione 3 del protocollo) (Figura 4). Gene rRNA 16S Dai campioni staccati di foglie e radici raccolti negli esperimenti sopra descritti, identificare i microbi endofiti (cioè i microbi che vivono all’interno dei tessuti vegetali). Lavare i campioni di piante con acqua di rubinetto e quindi sterilizzarli per rimuovere i microbi epifiti (cioè i microbi sulla superficie dei tessuti vegetali). Sterilizzare con candeggina al 3% per 3 minuti, seguita da una soluzione di etanolo al 70% per 1 minuto e lavare tre volte con acqua ultrapura autoclavata per 1 minuto ciascuno. Congelare i campioni a -80 °C fino all’estrazione del DNA genomico. Eseguire l’estrazione del DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA vegetale disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. Target le regioni variabili V6-V8 del gene rRNA 16S da campioni di DNA estratti utilizzando un approccio nidificato con primer discriminanti che si legano specificamente al DNA batterico18, riducendo così al minimo l’amplificazione dal DNA della pianta ospite. Dopo tre cicli di reazione a catena della polimerasi (PCR), etichettare il gene bersaglio con sequenze di codici a barre e adattatori per prepararlo come modello per il sequenziamento. Seguire i passaggi 2.1.7- 2.1.11 per l’amplificazione PCR Preparare la miscela master PCR per il numero richiesto di campioni in modo che ogni reazione abbia un volume totale di 30 μLof e sia composta da 30 ng di DNA, 1x tampone PCR, 0,2 mM dNTPs, 0,3 μM di ciascun primer e 2000 U/mL DNA polimerasi. Seguire lo stesso passo per il secondo e il terzo ciclo di PCR. Per il primo ciclo di PCR, utilizzare i primer 799F19 e 1492R (modificati da20) (Tabella 1). Impostare il profilo di amplificazione sul termociclatore (denaturazione iniziale di 3 minuti a 95 °C, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 45 s, ricottura a 54 °C per 45 s ed estensione a 72 °C per 1 min). Effettuare l’estensione finale a 72 °C per 5 min. Come modello per il secondo ciclo di PCR, verificare l’amplificazione mediante elettroforesi (5 μL dei prodotti PCR su gel di agarosio all’1,5%) e quindi diluire il resto 25 μL del prodotto PCR in acqua ultrapura autoclavata nel rapporto di 1:10. Ripetere la PCR con i modelli di PCR diluiti e primer uni-1062F21 e uni-1390R22 (Tabella 1). Mantenere le stesse condizioni di reazione PCR e lo stesso profilo di amplificazione (fase 2.1.8) tranne ridurre il numero di cicli a 25. Diluire i prodotti PCR risultanti in acqua ultrapura autoclavata nel rapporto di 1:1. Eseguire il terzo ciclo di PCR per etichettare i prodotti con i codici a barre e la sequenza adattatore P1 con 8 cicli dello stesso profilo PCR come menzionato al punto 2.1.8. Preparazione della biblioteca Verificare la concentrazione e la qualità dei prodotti PCR su un bioanalizzatore e raggruppare i volumi che costituiscono 30 ng di DNA di ciascun campione in un tubo da 1,5 ml per preparare una libreria equimolare. Selezionare gli ampliconi di dimensione 350-550 bp per frazionamento dimensionale utilizzando un sistema automatizzato di selezione delle dimensioni del DNA su una cassetta di gel di agarosio. Si noti che questo elimina anche gli ampliconi non specifici e i reagenti PCR dalla libreria. Raccogliere l’elute costituito da ampliconi della dimensione specificata in una fiala nella cassetta, ottenendo una libreria genica di rRNA 16S purificata. Pipettare l’elute in un tubo da 1,5 ml e verificare la purezza e la concentrazione sul bioanalizzatore. Diluire la libreria del DNA utilizzando acqua ultrapura autoclavata fino ad una concentrazione finale di 26 pM; il campione è pronto per il sequenziamento. SUONOTA: la regione ITS viene amplificata utilizzando primer specifici per ITS (Tabella 1) e il prodotto PCR risultante è etichettato con codici a barre e una sequenza adattatore P1 per il sequenziamento. Preparare il master mix PCR secondo lo stesso protocollo menzionato al paragrafo 2.1 con i primer ITS . Impostare il profilo di amplificazione sul termociclatore come denaturazione iniziale di 5 minuti a 95 °C, seguita da 35 cicli di denaturazione, ricottura ed estensione a 95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s, 72 °C per 1 min, rispettivamente, ed estensione finale 72 °C per 7 min. Analizzare 5 μL del prodotto PCR su gel di agarosio all’1,5% e diluire i restanti 25 μL a 1:10 utilizzando acqua ultrapura autoclavata. Utilizzare il prodotto PCR diluito come modello per il secondo ciclo di PCR. Preparare la miscela master PCR per il numero richiesto di campioni (fare riferimento al passaggio 2.1.6) con primer in avanti con tag barcode e primer inversi con adattatore P1. Amplificare con lo stesso profilo di amplificazione del passaggio 2.3.2, tranne che utilizzando 8 cicli. Preparare i prodotti PCR risultanti per il sequenziamento secondo i protocolli menzionati al paragrafo 2.2. Gene EPSPS Sequenziare e analizzare i geni EPSPS dei microbi.NOTA: Nell’interesse di scoprire se l’esposizione alla GBP ha cambiato la composizione dei microbi sensibili al glifosato e resistenti nella comunità, i geni EPSPS dei microbi devono essere sequenziati e analizzati. Pertanto, sono state raccolte 353 sequenze di geni EPSPS da un’ampia collezione di taxa microbici nel database Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC) e tutte le sequenze proteiche sono state allineate22. Questi allineamenti sono disponibili nel database ATGC23 e possono essere utilizzati per generare primer da regioni conservate. Uno strumento bioinformatico facile da usare è progettato per identificare le regioni conservate da un allineamento a sequenza multipla, e questo è disponibile a pagina24 della ricerca di Pere Puigbo. Tuttavia, non rientra nell’ambito di questa pubblicazione fornire una descrizione dettagliata di questo server Web. Tuttavia, un protocollo prospettico per utilizzare questi primer per l’amplificazione del gene EPSPS per trovare la sensibilità del microbioma al glifosato è fornito nella Figura 4. 3. Raccolta di sequenze proteiche EPSPS da repository pubblici Sequenze EPSPS da utilizzare negli studi di macroevoluzione Raccogliere proteine EPSPS da repository pubblici come PFAM23 (un database di famiglie proteiche25), GenBank24 (un database di geni, genomi e proteine26 ), COG25 (Clusters of Orthologous Groups27; un database di proteine ortologhe da archaea e batteri); e PDB26 (Protein Data Bank28; un database di strutture proteiche).NOTA: Un recente studio condotto dai ricercatori ha dimostrato che queste proteine potrebbero essere utilizzate per eseguire analisi microevoluzionarie e comparative del potenziale effetto del glifosato sugli organismi che hanno la via dello shikimate12. Gli autori hanno sviluppato un sito web user-friendly che raccoglie informazioni su decine di migliaia di sequenze proteiche EPSPS29, tra cui un set di dati curato manualmente di proteine dal microbioma intestinale umano12. Le informazioni contenute in questi set di dati pre-calcolati includono l’attuale classificazione EPSPS in putativo sensibile e resistente al glifosato, informazioni tassonomiche sulle specie, annotazioni del sito attivo EPSPS e collegamenti a database PDB e NCBI. Inoltre, il server web include i codici ID dell’EPSPS e collegamenti a diversi database esterni (Tabella 2). Sequenze EPSPS da utilizzare negli studi di microevoluzione ATGCNOTA: I depositi generali di sequenze proteiche sono utili per condurre studi comparativi tra organismi relativamente distanti; tuttavia, il potenziale effetto del glifosato è relativamente recente da un punto di vista evolutivo. Pertanto, in alcuni studi, è necessario confrontare specie strettamente correlate (ad esempio, ceppi diversi della stessa specie batterica) per determinare l’effetto del glifosato14. In questi casi, il database di Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30, che contiene un elenco completo di genomi archeali e batterici strettamente correlati, è una risorsa più adatta. Il database ATGC contiene informazioni su diversi milioni di proteine provenienti da migliaia di genomi organizzati in centinaia di cluster30. Ogni cluster di genoma è allineabile (i genomi condividono la sintenia oltre ≥85% delle loro lunghezze) e stretto (con un tasso di sostituzione sinonimo al di sotto della saturazione). I ricercatori hanno utilizzato il set di dati ATGC in un recente studio per analizzare i cambiamenti microevolutivi nelle proteine EPSPS14. I seguenti passaggi sono necessari per identificare la sequenza proteica EPSPS nell’ATGC: Scaricare l’intero database di ATGC dal link31 e tutte le proteine del COG0128 (codice corrispondente alle proteine EPSPS nel database)32 in un progetto locale.NOTA: Se i ricercatori/sperimentatori hanno sede in Finlandia, il CSC-IT Center for Science33 fornisce servizi di archiviazione e software. È importante raccogliere tutte le sequenze in formato FASTA. Costruito un database di blasti del COG0128 che contiene ortologhi della proteina EPSPS in un insieme rappresentativo di specie di procarioti. Il CSC ha il programma blast34 preinstallato, che consente l’uso del comando makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot per creare un database di riferimento di sequenze EPSPS. Mappare il database ATGC sul COG0128.fa (proteine EPSPS) utilizzando una ricerca blast iterativa con il comando blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150. Di conseguenza, crea un set di dati di sequenze proteiche EPSPS all’interno di ciascuna. Un set di dati pre-calcolato di sequenze proteiche EPSPS strettamente correlate dal database ATGC è disponibile29. 4. Algoritmo per determinare la potenziale sensibilità degli organismi al glifosato (server web EPSPSClass: input, processing e outputs) NOTA: I ricercatori hanno implementato un server facile da usare che è liberamente disponibile a 29 per determinare la classe di sequenze proteiche EPSPS12,35. Il server richiede solo un input di sequenza proteica in formato FASTA per determinare la percentuale di identità per ciascuna delle classi EPSPS e la loro potenziale sensibilità al glifosato. Inoltre, gli utenti possono utilizzare il server web per testare le proprie sequenze di riferimento e marcatori di amminoacidi. Innanzitutto, l’algoritmo (Figura 5) allinea le sequenze di query e le sequenze di riferimento utilizzando un programma di allineamento di sequenze multiple35 per determinare le posizioni degli amminoacidi. Quindi, cerca la presenza di marcatori di amminoacidi per identificare la classe EPSPS (I, II, III o IV) della sequenza di query. Introdurre una sequenza proteica EPSPS in formato FASTA nella casella di testo di input per identificare la classe dell’enzima (Figura 6A) e premere Invia. Valutare la potenziale sensibilità della sequenza di query al glifosato (Figura 6B-E) dagli output forniti dal server:Output 1: Frazione di marcatori di amminoacidi (cioè identità) presenti nelle sequenze di query (classe I, II e IV) e numero di motivi (classe III).Output 2: Allineamenti della query e sequenze di riferimento in base ai residui del marcatore.Output 3: Allineamenti completi a coppie delle sequenze di query e di riferimento.Output 4: Sequenze di riferimento EPSPS: Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPS, classe III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, classe IV). Alla fine della pagina di output, trovare collegamenti a strumenti esterni come blastp e domini conservati per analizzare ulteriormente la sequenza EPSPS della query (Figura 6F). 5. Valutazione della classe EPSPS da marcatori microbici universali (16S rRNA e ITS ) NOTA: La maggior parte degli studi sul microbioma si basa sull’analisi dell’rRNA 16S e/o dell’ITS36. In questi casi, non è possibile eseguire un’analisi diretta della sequenza EPSPS. Pertanto, è necessario un approccio probabilistico per stimare la potenziale sensibilità degli organismi al glifosato. Questa analisi è semplice e fornisce una stima ragionevole del tipo di sequenze EPSPS in un progetto di microbioma. Il processo è diviso in 3 fasi (Figura 7 e Figura 8): Identificare le sequenze EPSPS dai repository pubblici. La classe EPSPS di un set di dati completo di sequenze rappresentative è stata compilata e pre-calcolata da PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Accedere a questi set di dati dalla pagina principale del server EPSPSClass, contenente informazioni tassonomiche e la classe EPSPS di oltre 50.000 sequenze (Figura 7). Misurare l’altezza delle piante sperimentali bisettimanalmente durante la stagione di crescita e pesare la biomassa fuori terra delle piante alla fine della stagione di campo per confrontare la crescita delle piante in GBP e controllare i terreni.NOTA: Le analisi del microbiota degli esperimenti sul campo non sono ancora state completamente analizzate. Usa un foglio di calcolo per mappare le OTU batteriche (basate su rRNA 16S o ITS) da esperimenti sul microbioma in set di dati pre-calcolati.NOTA: Studi precedenti hanno dimostrato che la classe EPSPS (cioè la sensibilità intrinseca al glifosato) è altamente conservata all’interno di un gruppo filogenetico14. Pertanto, è relativamente sicuro supporre che specie strettamente imparentate da taxon altamente conservati possano avere risposte EPSPS simili al glifosato (Figura 8). Nello stesso foglio di calcolo, calcolare la sensibilità intrinseca al glifosato, in base a un punteggio probabilistico (S = s / (s + r + u) dove S: Punteggio di sensibilità; s: numero di sequenze potenzialmente sensibili; r: numero di sequenze potenzialmente resistenti; u: numero di sequenze non classificate) calcolato da sequenze EPSPS note in database pubblici.NOTA: questo punteggio varia da 0 (non si trovano sequenze EPSPS sensibili in un taxon) a 1 (tutte le sequenze in un taxon sono sensibili al glifosato) (Figura 8). Inoltre, ci sono valori intermedi, cioè specie con ceppi sensibili, resistenti o sconosciuti.

Representative Results

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una pipeline generale, dagli esperimenti sul campo alle analisi bioinformatiche, che quantifichi la potenziale sensibilità degli organismi all’erbicida glifosato. Nell’esperimento 2 la concentrazione media di glifosato nel mangime per quaglie era di 164 mg/kg e la concentrazione media di glifosato dei campioni di escrementi (urina e materia fecale combinate) era di 199 mg/kg. Le lettiere raccolte da quaglie alimentate con mangimi contaminati da GBP avevano, in media, 158 mg /kg e lettiere di controllo di 0,17 mg / kg di glifosato (Tabella 3). Negli esperimenti sul campo, le specie vegetali hanno risposto in modo diverso ai residui di glifosato nei terreni (sezione 1). La biomassa di avena e colza di rape era maggiore nei terreni di controllo rispetto ai terreni trattati con GBP. Tuttavia, le fave e le patate sembravano beneficiare del trattamento CON GBP alla fine della stagione di crescita15. Il glifosato nel letame di pollame ha ridotto la crescita delle piante nell’erba (Festuca pratensis) e nella fragola (Fragaria x vescana) (sezione 1). Le analisi del microbiota degli esperimenti sul campo non sono ancora state completamente analizzate e non sono presentate qui (sezione 2). I risultati di questo protocollo, se letti direttamente (come mostrato nelle sezioni 3 e 4) o indirettamente (sezione 5), forniscono una misura della proporzione di organismi potenzialmente sensibili e resistenti al glifosato in un set di dati (Figura 9). L’uso di questo metodo è stato testato con una raccolta di sequenze proteiche EPSPS da specie microbiche del microbioma intestinale umano di base che sono state ottenute da archivi pubblici12. Nello studio, 890 ceppi delle 101 specie batteriche più abbondanti sono stati analizzati con il metodo EPSPSClass per quantificare la proporzione di batteri sensibili e resistenti. I risultati hanno mostrato che il 54% delle specie nel microbioma intestinale umano principale sono potenzialmente sensibili al glifosato12. Questa tendenza è osservata anche nella maggior parte del mondo procariotico; inoltre, negli eucarioti (principalmente piante e funghi), la percentuale di specie potenzialmente sensibili è ancora più alta12. Inoltre, abbiamo utilizzato questo metodo per quantificare i cambiamenti di sensibilità nella proteina EPSPS a livello microevolutivo (Figura 10)14. Abbiamo identificato cambiamenti nello stato di sensibilità in 12 dei 32 gruppi strettamente correlati di procarioti analizzati (Tabella 4)14. Pertanto, l’uso continuo dei GBP può produrre disbiosi microbica (cioè uno squilibrio di specie batteriche sensibili e resistenti) nei microbiomi vegetali, animali e del suolo. Inoltre, è stato ipotizzato che un aumento dei batteri resistenti al glifosato possa promuovere microbiomi multiresistenti 14,41,42. Pertanto, questo protocollo fa luce sull’interpretazione di tutti questi scenari, poiché il metodo di classificazione EPSPS fornisce una stima diretta della sensibilità intrinseca dei microbiomi al glifosato. A causa della sensibilità intrinseca della proteina EPSPS al glifosato che è filogeneticamente conservata14, è possibile estrapolare i risultati da set di dati esistenti in microbiomi sconosciuti (Figura 8). Figura 1: Pipeline generale Questa è una pipeline generale per analizzare la sensibilità alla GBP dagli esperimenti sul campo all’analisi bioinformatica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Esperimento sul campo 1 per testare gli effetti dei residui di GBP sui microbi associati alle piante delle colture. Il campo sperimentale è costituito da 10 lotti di controllo alternati e 10 lotti di trattamento GBP (23 m x 1,5 m) con fasce tampone da 1,5 m tra i lotti. Due volte all’anno dal 2014, i lotti GBP sono stati trattati con GBP commerciale (concentrazione di glifosato 450 g L-1, tasso di applicazione 6,4 L ha-1 in 5 L di acqua di rubinetto per appezzamento) e i terreni di controllo con la stessa quantità di acqua di rubinetto senza glifosato. I trattamenti sono stati applicati con un serbatoio a pressione azionato a mano utilizzando un cappuccio di plastica nella punta dell’irrigatore per proteggere i GBP dalla diffusione al di fuori delle trame di trattamento. Dopo un periodo di sicurezza di due settimane a seguito dell’applicazione della GBP, sono state seminate avena (Avena sativa), fave (Vicia faba) e colza di rapa (Brassica rapa subsp. oleifera) e patate (Solanum tuberosum) sono state piantate negli appezzamenti. I campioni di microbiota delle piante coltivate studiate, foglie e radici, sono stati raccolti più volte dall’inizio dell’esperimento nel 2014. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: L’esperimento sul campo 2 ha testato le conseguenze dei residui di GBP nel fertilizzante per letame per due colture perenni e il loro microbiota associato. Le lettiere raccolte da un esperimento di voliera di 12 mesi con quaglie giapponesi alimentate con mangimi di controllo o contaminati da GBP sono state utilizzate come fertilizzante per letame in un esperimento sul campo. Il campo sperimentale consisteva in 18 grafici di controllo e 18 GBP (1 m x 1 m) disposti in una griglia a scacchiera 6 x 6. Le lettiere sono state distribuite sul campo sperimentale due volte, ad agosto 2018 e maggio 2019 (25 L / trama). I terreni di controllo sono stati fertilizzati con lettiere raccolte da quaglie alimentate con mangimi di controllo e appezzamenti gbp con lettiere da quaglie alimentate con mangimi contaminati da GBP. I residui di glifosato nelle lettiere di controllo erano 0,17 mg / kg di glifosato e nella lettiera GBP, la quantità era di 158 mg / kg di glifosato. Due endofiti-simbiotici (E+), due endofiti liberi (E-) Festuca pratensis e due Fragaria x vescana sono stati piantati per appezzamento nel settembre 2018, circa un mese dopo la diffusione delle prime lettiere. Le misurazioni delle prestazioni e della forma fisica delle piante, nonché il campionamento per il microbiota associato a radici e foglie sono state condotte durante due stagioni di crescita consecutive (2019 e 2020). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Analisi dei taxa microbici utilizzando il gene rRNA 16S/regione ITS e sensibilità dei microbiomi al glifosato utilizzando il gene EPSPS . (A) Analisi delle sequenze di rRNA 16S o ITS per identificare i taxa microbici. (B) Analisi delle sequenze EPSPS per identificare la sensibilità dei microbi al glifosato (GS-glifosato sensibile / GR-glifosato resistente) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Algoritmo per identificare la classe di sequenze proteiche EPSPS. L’input è una sequenza proteica EPSPS in formato FASTA. L’algoritmo esegue confronti con marcatori di amminoacidi noti in sequenze proteiche di riferimento che determinano la potenziale sensibilità al glifosato. L’algoritmo è stato implementato sul server web liberamente accessibile EPSPSClass29. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Ingressi e uscite di base del server Web EPSPSClass. (A) Input: una sequenza proteica EPSPS in formato FASTA. (B) Output 1 – identità: frazione di marcatori di amminoacidi presenti nelle sequenze di query (Classi I-IV) e nei motivi (Classe III). (C) Output 2 – identità: allineamenti della query e sequenze di riferimento. (D) Output 3 – allineamenti a coppie delle sequenze di query e di riferimento. (E) Sequenze EPSPS di riferimento: Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (F) Link per eseguire ulteriori ricerche blastp e identificazione di domini conservati Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Accesso a set di dati precompresci di sequenze EPSPS. Seguire le indicazioni in figura per accedere al set di dati pre-calcolato delle sequenze EPSPS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Esempio di come stimare la sensibilità potenziale nei progetti di microbioma senza sequenze EPSPS. L’esempio utilizza i valori del database di Alignable Tight Genomic Clusters30, che contiene sequenze di specie procariotiche. Specie ipotetiche di un progetto di microbioma sono Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci e Sulfolobus islandicus. Il punteggio di sensibilità al glifosato è calcolato come Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Schema di interpretazione dei risultati di questo protocollo e ipotetici scenari evolutivi. (A) In un microbioma, la proporzione di batteri di potenziale sensibilità (in verde) e resistenza (in rosso) è di circa 50:50. I punti neri denotano specie microbiche non classificate; pertanto, la loro sensibilità al glifosato è sconosciuta. In alcuni microbiomi, la proporzione di batteri sensibili è leggermente più alta, come nel microbioma intestinale umano12. (B) Nel corso del tempo, l’uso del glifosato può portare a disbiosi microbica (cioè uno squilibrio nella proporzione di batteri sensibili e resistenti) che porta a diversi scenari ipotetici. (C) Caso ipotetico 1 (nessuna selezione): l’uso del glifosato non influenza il microbioma; pertanto, la proporzione di batteri sensibili e resistenti rimane costante. (D) Caso ipotetico 2: L’uso del glifosato rimuove i batteri sensibili al glifosato dalla popolazione. Ipotizziamo che questo scenario possa essere dose-dipendente. (E) Caso ipotetico 3: la pressione di selezione derivante dall’uso del glifosato aumenta le mutazioni nel gene EPSPS che modificano lo stato di sensibilità dei batteri. Pertanto, l’intera popolazione microbica diventa resistente al glifosato. Inoltre, in questo scenario, potrebbe esserci un aumento dei batteri multiresistenti. (F) Caso ipotetico 4: l’uso del glifosato altera la composizione di alcune specie batteriche, producendo uno squilibrio nei confronti dei batteri resistenti, mentre alcune specie batteriche rimangono inalterate, probabilmente a causa di meccanismi di resistenza aggiuntivi come le pompe di efflusso o per sovraespressione del gene EPSPS 13. Questo scenario può anche portare ad un aumento dei batteri resistenti al glifosato, nonché ad un aumento della resistenza batterica ad antibiotici aggiuntivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10: Distribuzione della sensibilità prevista al glifosato attraverso l’albero delle specie. I grafici a torta indicano la proporzione di specie che sono presumibilmente sensibili (verde) o resistenti (rosso) al glifosato e non classificate (nere). Questa figura è stata adattata con il permesso di Rainio et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 11: Input e output del server web EPSPSClass per testare la sequenza di riferimento dell’utente. (A) Input 1: sequenza di query. (B) Ingresso 2: sequenza di riferimento. (C) Input 3: marcatori di amminoacidi nelle sequenze di riferimento. (D) Output: identità: frazione di marcatori di amminoacidi nelle sequenze di query (classe I-IV e sequenze di riferimento proprie dell’utente). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Elenco dei primer per l’amplificazione PCR del gene rRNA 16S e della regione ITS nell’analisi del microbioma Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Codici dell’enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in diversi database Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Concentrazione media di glifosato Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Tabella riassuntiva della percentuale di specie sensibili/resistenti al glifosato. Questa tabella è stata adattata con il permesso di Rainio et al.14. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 5: Posizioni dei marcatori di amminoacidi nelle sequenze di riferimento Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo protocollo fornisce una guida generale su come quantificare l’effetto della GBP sui microbiomi sulla base dell’analisi della proteina EPSPS. Il protocollo ha tre principali passaggi critici: (i) Quantificazione della proteina EPSPS dai dati del microbioma. Questo passaggio è fondamentale perché EPSPS è l’enzima bersaglio diretto dell’erbicida. Pertanto, le specie che hanno una copia del gene EPSPS possono essere influenzate dall’uso di GBP. Tuttavia, anche le specie che non hanno una copia del gene EPSPS possono essere influenzate dall’erbicida attraverso meccanismi alternativi non bersaglio^43,44. (ii) Se l’analisi del gene EPSPS non è inclusa nella progettazione dello studio, è possibile ottenere una buona stima analizzando l’rRNA 16S (batteri) o ITS (funghi). In questo caso, è essenziale fare affidamento su una tabella di riferimento completa (ad esempio, il database ATGC fornisce sequenze della proteina EPSPS di diverse specie strettamente correlate). (iii) La proteina EPSPS è suddivisa in potenzialmente sensibile o resistente al glifosato a seconda di alcuni residui di amminoacidi del sito attivo dell’EPSPS. Tuttavia, le mutazioni che interessano un singolo amminoacido possono alterare questa classificazione⁴⁵ e le transizioni tra le classi possono verificarsi in un periodo di tempo relativamente breve¹⁴.

La potenziale sensibilità degli organismi al glifosato può essere determinata da genomi di riferimento, marcatori di amminoacidi e allineamenti di sequenza. (i) Genomi di riferimento: l’enzima EPSPS può essere classificato come potenzialmente sensibile (classe I [alfa o beta]^46,47) o resistente (classi II^48,49, III⁵⁰ e IV⁵¹) al glifosato in base alla presenza di marcatori e motivi aminoacidici (nel caso della classe III). Questi marcatori e motivi di amminoacidi si basano sulla posizione dei residui di aminoacidi nella proteina EPSPS di Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III) e Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (ii) Marcatori aminoacidici: il glifosato interagisce con l’enzima EPSPS e compete con il fosfoenolpiruvato (PEP, il secondo substrato dell’enzima EPSPS)^52,53. In alcune specie, piccoli cambiamenti di aminoacidi nella sequenza EPSPS forniscono una maggiore affinità per il PEP e una resistenza al glifosato 12,14,52,54,55. In altre sequenze, il glifosato lega la sequenza EPSPS in una conformazione non inibitoria ⁴⁵. Sebbene siano state descritte molte sequenze resistenti ^{12,14,48,49,52,54,55} e tolleranti ^56,57 EPSP al glifosato, l’attuale sistema di classificazione per l’EPSPS è diviso in quattro classi principali (I-IV)¹² (Tabella 5 ). (iii) Allineamenti di sequenza: Al fine di classificare un enzima EPSPS, abbiamo eseguito allineamenti a coppie, con un programma di allineamento a sequenza multipla-parametri predefiniti³⁵-, della sequenza di query rispetto a ciascuna delle sequenze di riferimento (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS e sdEPSPS). Questi allineamenti sono necessari per identificare le posizioni dei marcatori di amminoacidi nella sequenza di query. Di conseguenza, un enzima è classificato come descritto^12-classe I, II e/o IV in base alla presenza di marcatori di amminoacidi e marcatori di motivo di classe III.

Il protocollo si basa su quattro tipi noti di EPSPS: un tipo è sensibile, gli altri tre sono resistenti). Tuttavia, circa il 10% delle sequenze di EPSPS nei procarioti non sono ancora classificate (16% negli archaea e 8% nei batteri)¹². Pertanto, ulteriori ricerche dovrebbero analizzare quelle sequenze per determinare la sensibilità al glifosato. Il server EPSPSClass offre un’opzione per testare nuovi marcatori genetici. L’identificazione delle classi note dell’EPSPS è semplice, come mostrato al punto 4.4. e Figura 5. Inoltre, nei casi in cui gli utenti desiderano confrontare le proprie proteine di query e di riferimento, il server offre la possibilità di includere manualmente una sequenza di riferimento e un set di marcatori di amminoacidi (Figura 11). Questa opzione può essere utilizzata per identificare nuove classi di EPSPS, nonché per testare altri erbicidi e sequenze target.

L’analisi della classe EPSPS è determinata dall’analisi di sequenza e dalla presenza/assenza di marcatori aminoacidici. Questa è una stima preliminare che può essere utilizzata per test di ipotesi sul campo. I marcatori aminoacidici sono stati determinati in letteratura sulla base di studi empirici e osservazionali 46,47,48,49,50,51. Tuttavia, le sequenze proteiche di riferimento per determinare la classe EPSPS sono state testate solo in un numero limitato di specie e possono occasionalmente non riuscire a spiegare la resistenza al glifosato. L’effetto delle mutazioni compensatorie e dei domini associati all’EPSPS (principalmente nei funghi) può anche influenzare la sensibilità al glifosato⁵⁸. L’analisi di questo documento si basa su quattro classi EPSPS. Un’indagine sui batteri nel microbioma intestinale umano ha mostrato che circa il 30% di essi non erano classificati (cioè, le proteine EPSPS di queste specie non appartengono a nessuna delle classi conosciute) e sono necessari ulteriori studi per identificare altre classi EPSPS. Inoltre, va notato che la sequenza proteica EPSPS nei batteri e nelle piante è unidominio, mentre le proteine EPSPS fungine contengono diversi domini⁵⁹. Pertanto, un ripiegamento proteico nei funghi può portare a una diversa risposta dell’enzima EPSPS al glifosato. Inoltre, non vengono considerati ulteriori meccanismi non bersaglio di resistenza (ad esempio, pompe di efflusso e sovraespressione del gene EPSPS ¹³) o sensibilità al glifosato (ad esempio, l’effetto del glifosato sulla catena di trasporto mitocondriale¹²).

Sebbene i GBP siano in circolazione come erbicida dal 1974 e siano stati ampiamente utilizzati dal 1991, questo è il primo metodo bioinformatico per determinare la potenziale sensibilità degli organismi al glifosato. Il metodo si basa sull’identificazione di residui di amminoacidi noti nella sequenza target. Pertanto, il nostro metodo fornisce una stima di base del potenziale effetto del glifosato sulla specie. Nel prossimo futuro, nuovi metodi bioinformatici dovrebbero includere ulteriori classi della proteina EPSPS per determinare la potenziale sensibilità al glifosato di sequenze non classificate 12,54,55. Inoltre, dato che il comportamento esatto dell’enzima EPSPS può variare in base alle variazioni dei singoli amminoacidi 12,14,52,54,55, ulteriori esperimenti in silico dovrebbero tenere conto di piccole variazioni nel ripiegamento della proteina EPSPS, nonché dell’effetto dei domini associati all’EPSPS sulla struttura proteica nei funghi⁵⁸ . Inoltre, è stato dimostrato che la tolleranza al glifosato può essere prodotta dalla sovraespressione della proteina EPSPS^56,57; quindi le analisi bioinformatiche basate sul miglioramento dell’uso del codone⁶⁰ possono essere utilizzate per identificare nuove sequenze EPSPS che massimizzano o minimizzano l’espressione genica.

Gli agricoltori, i politici e i responsabili delle decisioni hanno urgente bisogno di una conoscenza approfondita dei rischi associati all’uso pesante di pesticidi. Pertanto, sono necessari sia strumenti bioinformatici che rivelino la potenziale sensibilità degli organismi ai pesticidi sia studi sperimentali ben replicati, randomizzati e realistici sul campo condotti in ambienti diversi. Il metodo bioinformatico presentato progettato per esaminare la sensibilità degli organismi al glifosato può essere modulato per altri pesticidi. Allo stesso modo, i metodi dell’ecologia sperimentale possono essere applicati per studiare qualsiasi questione ecologica correlata. Insieme, i metodi possono essere utilizzati per dimostrare le vittime tra osservazioni sul campo, dati genomici e uso di pesticidi. Tutti i metodi presentati sono preziosi nella valutazione del rischio. I metodi bioinformatici possono essere utilizzati, ad esempio, per monitorare gli adattamenti microbici ai prodotti agrochimici e per fornire un metodo quantitativo per testare i potenziali altri rischi associati, come un aumento della resistenza degli agenti patogeni ai prodotti agrochimici, effetti negativi sui microbi utilizzati come agenti di controllo biologico nella gestione integrata dei parassiti (IPM) e resistenza agli antibiotici nei batteri.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	INVITEK Molecular	1037100300	Genomic DNA extraction from plant tissues
dNTP mix (10 mM each)	BIO-RAD	1852196	For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit	Promega	M7848	PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit	Agilent	G2939B	To check the concentration and quality of PCR products
Ion Chip Minifuge	sage science	PIP0001	For size fractionation of PCR amplicons
Ion PGM System	ThermoFisher Scientific	4462921	For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server	ThermoFisher Scientific	4483643	For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep	ThermoFisher Scientific	4479672	For targeted sequencing of microbial PCR products
Pressure tank	Berthoud	102140	For sprayin glyphosate based products in field
Primers	ThermoFisher Scientific	R0192	For PCR amplification
Rotary tiller	Grillo	984511	For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler	Sigma-Aldrich	Custom-made	For PCR amplification