Summary

Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

Published: January 19, 2022
doi:

Summary

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Abstract

Produtos químicos sintetizados por plantas, fungos, bactérias e invertebrados marinhos têm sido uma rica fonte de novos hits e leads de drogas. Medicamentos como estatinas, penicilina, paclitaxel, rapamicina ou artemisina, comumente utilizados na prática médica, foram primeiramente identificados e isolados de produtos naturais. No entanto, a identificação e isolamento de metabólitos especializados biologicamente ativos de fontes naturais é um processo desafiador e demorado. Tradicionalmente, os metabólitos individuais são isolados e purificados a partir de misturas complexas, após a extração da biomassa. Posteriormente, as moléculas isoladas são testadas em ensaios funcionais para verificar sua atividade biológica. Aqui apresentamos o uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) para identificar compostos biologicamente ativos diretamente de misturas complexas. As colunas CMAC permitem a identificação de compostos interagindo com proteínas transmembrana funcionais imobilizadas (TMPs) incorporadas em seu ambiente bicamador nativo fosfolipídico. Trata-se de uma abordagem direcionada, que requer conhecer o TMP cuja atividade se pretende modular com o recém-identificado candidato a pequenas moléculas. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para preparar colunas CMAC com tropomyosina quinase imobilizada receptor B (TrkB), que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para montar a coluna CMAC com receptores TrkB imobilizados usando linhas celulares neuroblastoma superexpressando receptores TrkB. Apresentamos ainda a abordagem para investigar a funcionalidade da coluna e seu uso na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com receptores TrkB.

Introduction

As misturas botânicas são ricas em compostos farmacologicamente ativos1, servindo como uma boa fonte para a identificação de novos hits de drogas e leva 2,3,4,5. A descoberta de novos medicamentos a partir de produtos naturais tem sido uma abordagem frutífera e muitos medicamentos atualmente aprovados originaram-se de compostos identificados pela primeira vez na natureza. A diversidade química de compostos naturais é difícil de ser comparada por bibliotecas feitas pelo homem de moléculas quimicamente sintetizadas. Muitos compostos naturais interagem e modulam alvos de proteína humana e podem ser considerados moléculas evolutivamente otimizadas como drogas6. Estes compostos naturais são particularmente adequados para a identificação de chumbo de drogas para uso em distúrbios neurológicos6. Dois dos medicamentos atualmente aprovados pela FDA para o manejo da doença de Alzheimer (DA) são derivados de alcaloides naturais, a ver: galantamina e rivastigmina (um derivado da fisstigmina)6. L-DOPA, atualmente o medicamento mais comumente prescrito para doença de Parkinson, foi identificado pela primeira vez a partir do feijão largo (Vicia faba L.) 7. Pergolida e lisúride, agonistas receptores dopaminérgicos são os derivados de alcaloides naturais do fungo parasita Claviceps purpurea8. Reserpine, um alcaloide isolado da raiz de cobra indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) foi uma das primeiras drogas antipsicóticas9. Recentemente, a resposta imune disregulada e a inflamação sistêmica têm sido ligadas ao desenvolvimento de inúmeras doenças neurológicas, como transtorno depressivo grave ou doenças neurodegenerativas10. Uma dieta à base de plantas, juntamente com outras intervenções de estilo de vida, tem sido encontrada para melhorar as habilidades cognitivas e funcionais em idosos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Algumas moléculas eletrofílicas pertencentes a triterpenos e polifenóis foram encontradas para modular respostas inflamatórias nos modelos in vitro e in vivo 12. Por exemplo, compostos naturais contendo carbonilo α.β insaturados (por exemplo, curcumina, cinnamaldeído), ou grupo isothiocyanato (por exemplo, sulforaphane) interfere com a dimerização do receptor-4 (TLR4) que inibe a síntese a jusante de citocinas pró-inflamatórias em uma linha de células pró-B dependentesde maça . Evidências epidemiológicas apontam fortemente que fitoquímicos dietéticos, presentes em matrizes alimentares complexas, também podem constituir uma fonte viável de novas drogas leva6.

Um dos principais obstáculos na identificação de moléculas biologicamente ativas presentes nos extratos vegetais, incluindo alimentos à base de plantas, é a complexidade das amostras investigadas. Tradicionalmente, os compostos individuais são isolados, purificados e posteriormente testados para atividade biológica. Essa abordagem geralmente leva à identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados. A descoberta de drogas fenotípicas se aproxima sem um alvo molecular definido, depende do fracionamento bioguisticuto de misturas complexas23. Nesta abordagem, um extrato é fracionado em sub frações menos complexas que são posteriormente testadas em ensaios fenotípicos. O isolamento e purificação dos compostos ativos são orientados pela atividade biológica verificada no ensaio. O conhecimento da identidade de um alvo de drogas especificado pode acelerar significativamente a identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em misturas complexas. Essas abordagens são geralmente baseadas na imobilização do alvo molecular, por exemplo, uma enzima, em uma superfície sólida, como as contas magnéticas23. Os alvos imobilizados são posteriormente usados nos experimentos de triagem, resultando no isolamento de compostos interagindo com o alvo. Embora essa abordagem tenha sido amplamente utilizada na identificação de compostos voltados para proteínas citosóicas, tem sido menos comumente aplicada na identificação de produtos químicos interagindo com proteínas transmembranas (TMPs)23. Um desafio adicional na imobilização dos TMPs decorre do fato de que a atividade da proteína depende de sua interação com fosfolipídios de membrana celular e outras moléculas na bicamada, como o colesterol 23,24. É importante preservar essas interações sutis entre proteínas e seu ambiente bicamfato fosfolipídico nativo ao tentar imobilizar o alvo transmembrano.

Na membrana celular a cromatografia de afinidade de membrana (CMAC) fragmentos de membrana celular, e não proteínas purificadas, são imobilizados nas partículas de fase estacionárias da membrana artificial (IAM)23. As fases estacionárias do IAM são preparadas por análogos de fosfatialina em sílica. Recentemente, novas classes de fases estacionárias do IAM foram desenvolvidas nas quais grupos gratuitos de amina e silanol são end-capped (IAM. Computador pessoal. Partículas DD2). Durante as colunas CMAC, fragmentos de membrana celular de preparação são imobilizados na superfície das partículas IAM através de adsorção.

As colunas CMAC têm sido usadas até o momento para imobilizar diferentes classes de TMPs, incluindo canais de íons (por exemplo, receptores nicotínicos), GPCRs (por exemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por exemplo, p-glicoproteína), etc.24. Os alvos de proteína imobilizada têm sido utilizados na caracterização da farmacodinâmica (por exemplo, constante de dissociação, Kd) ou determinando cinética de ligação (kon e koff) de ligantes de moléculas pequenas interagindo com o alvo, bem como no processo de identificação de potenciais novos cabos de droga presentes em matrizes complexas24 . Aqui apresentamos a preparação das colunas CMAC com o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) imobilizado, que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso.

Estudos anteriores mostraram que a ativação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)/TrkB está associada à melhora de certas doenças neurológicas, como DA ou transtorno depressivo grave 25,26,27,28. Foi relatado que os níveis de BDNF e sua expressão receptor TrkB diminuem em AD, e reduções semelhantes prejudicam a função hipocampal em modelos animais de AD29. A diminuição dos níveis de BDNF foi relatada em soro e cérebro de pacientes com DA 30,31,32. A superexpressão de Tau ou hiperfosforilação foram encontradas para diminuir a expressão BDNF em neurônios primários e modelos animais AD 33,34,35. Além disso, foi relatado que o BDNF tem efeitos protetores na neurotoxicidade induzida por β amiloide in vitro e in vivo36. A administração direta de BDNF no cérebro de rato mostrou-se aumentar o aprendizado e a memória em animais com deficiência cognitiva37. BDNF/TrkB emergiu como um alvo válido para amenização de distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo28,38 d.C. Direcionar o caminho de sinalização BDNF/TrkB para o desenvolvimento de terapias em DDa potencialmente melhorará nossa compreensão da doença39. Infelizmente, o BDNF em si não pode ser usado como tratamento devido às suas más propriedades farmacocinéticas e aos efeitos colaterais adversos40. Pequenos ativadores de moléculas de vias TrkB/BDNF foram explorados como potenciais ligantes TrkB 41,42,43. Entre os agonistas de pequenas moléculas testados, 7,8-dihidroxyflavone (7,8-DHF), foi mostrado para ativar a via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Um derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromne-7,8-diyl bis (metilcarbamate)) está atualmente em consideração como uma possível droga para AD47. Recentemente, foi demonstrado que vários antidepressivos trabalham diretamente ligados ao TrkB e promovendo a sinalização BDNF, enfatizando ainda mais a importância de perseguir o TrkB como um alvo válido para tratar vários distúrbios neurológicos48.

O protocolo descreve o processo de montagem da coluna TrkB funcional e da coluna de controle negativo TrkB-NULL. As colunas são caracterizadas por um produto natural conhecido ligante molecular: 7,8-DHF. Além disso, descrevemos o processo de triagem de matrizes complexas, utilizando como exemplo o extrato vegetal, para a identificação de compostos interagindo com trkB.

Protocol

1. Cultura celular das células neuroblastoma SH-SY5Y (linhas celulares TrkB e TrkB-NULL (parental) ) NOTA: As linhas de celular (linha celular SH-SY5Y (TrkB, BR6) e a linha de células parentais SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 foram compradas da Kerafast. As células cultivadas são usadas como fonte dos receptores transmembranos para serem imobilizadas para a preparação de colunas CMAC. As etapas a seguir descrevem como ob…

Representative Results

Seguindo o protocolo, foram montadas duas colunas cromatográficas CMAC: uma com fragmentos imobilizados de membrana celular neuroblastoma SH-SY5Y com TrkB superexpresso e outra com fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. A coluna CMAC corretamente montada é apresentada na Figura 1 e as etapas envolvidas na imobilização do fragmento de membrana celular são apresentadas na Figura 2. Desde a imobilização dos receptores T…

Discussion

A identificação de compostos ativos presentes em misturas complexas de metabólitos especializados é uma tarefa muito desafiadora23. Tradicionalmente, compostos individuais são isolados, e sua atividade é testada em diferentes ensaios. Essa abordagem é demorada e cara e muitas vezes leva ao isolamento e identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados23. Atualmente, os ensaios de triagem de alto rendimento utilizados dependem fortemente da triagem d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A Z.C.A. foi apoiada pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Centro Nacional de Medicina Complementar e Integrativa dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número 1R41AT011716-01. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pela American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, a Regis Technologies concedeu a L.C. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate Sigma-Aldrich D5446-10 mg ≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383-1 g
Ammonium acetate VWR Chemicals BDH BDH9204-500 g
BDNF antibody Invitrogen PA5-15198-400 μL Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate Sigma-Aldrich B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human Sigma-Aldrich B3795-10 μg Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride VWR Analytical BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt Alfa Aesar J62050-100 g
Dounce homogenizer VWR 71000-516 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol Sigma-Aldrich 493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR Analytical BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442-500 mL sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution Sigma-Aldrich G8168-100 mL 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol VWR Life Science E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) Regis Technologies, Inc. 1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate VWR Analytical BDH9244-500 mL
Methanol Sigma-Aldrich 322425
Nikon Plan Fluor Nikon Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%) Life Technologies 50197Z
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Thermo Scientific 36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS) VWR Life Science K812-500 mL 1x
Potassium chloride VWR Chemicals BDH 0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail VWR Life Science Ambreso M221-1 mL Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758-500 mL with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen Alexa Flour Plus 488 A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B Kerafast ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line Kerafast ECP005
Snake skin dialysis tubing Thermo Scientific 88245 10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium chloride BDH VWR Analytical BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column GE Healthcare 24-4064-08
Tris-HCl VWR Life Science 0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-500 mL 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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Arituluk, Z. C., Adhikari, B., Maitra, U., Goodman, C., Ciesla, L. M. Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B. J. Vis. Exp. (179), e63118, doi:10.3791/63118 (2022).

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