Zellmembranaffinitätschromatographiesäulen zur Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit dem immobilisierten Tropomyosinkinase-Rezeptor B interagieren

Summary

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von CMAC-Säulen (Cell Membrane Affinity Chromatography) mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die funktionelle Transmembran-Tropomyosin-Kinase-Rezeptor-B-Proteine enthalten. Die Verwendung von CMAC-Säulen bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit diesen Rezeptoren interagieren und in komplexen natürlichen Mischungen vorhanden sind, wird ebenfalls erläutert.

Abstract

Chemikalien, die von Pflanzen, Pilzen, Bakterien und wirbellosen Meerestieren synthetisiert werden, waren eine reiche Quelle für neue Drogen und Blei. Medikamente wie Statine, Penicillin, Paclitaxel, Rapamycin oder Artemisinin, die üblicherweise in der medizinischen Praxis verwendet werden, wurden zuerst identifiziert und aus Naturprodukten isoliert. Die Identifizierung und Isolierung von biologisch aktiven spezialisierten Metaboliten aus natürlichen Quellen ist jedoch ein herausfordernder und zeitaufwendiger Prozess. Traditionell werden einzelne Metaboliten nach der Extraktion von Biomasse aus komplexen Gemischen isoliert und gereinigt. Anschließend werden die isolierten Moleküle in funktionellen Assays getestet, um ihre biologische Aktivität zu überprüfen. Hier stellen wir die Verwendung von CMAC-Säulen (Cellular Membrane Affinity Chromatography) vor, um biologisch aktive Verbindungen direkt aus komplexen Gemischen zu identifizieren. CMAC-Säulen ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, die mit immobilisierten funktionellen Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, die in ihre native Phospholipid-Doppelschichtumgebung eingebettet sind. Dies ist ein gezielter Ansatz, der voraussetzt, den TMP zu kennen, dessen Aktivität man mit dem neu identifizierten niedermolekularen Wirkstoffkandidaten modulieren will. In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz zur Herstellung von CMAC-Säulen mit immobilisiertem Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich zu einem brauchbaren Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems entwickelt hat. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Montage der CMAC-Säule mit immobilisierten TrkB-Rezeptoren unter Verwendung von Neuroblastom-Zelllinien zur Überexpression von TrkB-Rezeptoren vor. Wir stellen ferner den Ansatz vor, die Funktionalität der Säule und ihre Verwendung bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten zu untersuchen, die mit TrkB-Rezeptoren interagieren.

Introduction

Botanische Mischungen sind reich an pharmakologisch aktiven Verbindungen¹ und dienen als gute Quelle für die Identifizierung neuer Arzneimittel-Hits und -Leads 2,3,4,5. Die Entdeckung neuer Medikamente aus Naturprodukten war ein fruchtbarer Ansatz, und viele derzeit zugelassene Medikamente stammen aus Verbindungen, die zuerst in der Natur identifiziert wurden. Die chemische Vielfalt von Naturstoffen ist schwer von künstlichen Bibliotheken chemisch synthetisierter Moleküle zu erreichen. Viele natürliche Verbindungen interagieren mit und modulieren menschliche Proteinziele und können als evolutionär optimierte arzneimittelähnliche Moleküle^{betrachtet werden 6}. Diese Naturstoffe eignen sich besonders gut für die Identifizierung von Wirkstoff-Blei zur Verwendung bei neurologischen Erkrankungen⁶. Zwei der derzeit von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AD) stammen aus natürlichen Alkaloiden, nämlich: Galantamin und Rivastigmin (ein Derivat von Physostigmin)^6. L-DOPA, derzeit das am häufigsten verschriebene Medikament gegen die Parkinson-Krankheit, wurde zuerst aus der breiten Bohne (Vicia faba L.) identifiziert. ⁷. Pergolid und Lisurid, dopaminerge Rezeptoragonisten sind die Derivate natürlicher Mutterkornalkaloide aus dem parasitären Pilz Claviceps purpurea⁸. Reserpine, ein aus der indischen Schlangenwurzel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) isoliertes Alkaloid, war eines der ersten Antipsychotika⁹. In jüngster Zeit wurden eine fehlregulierte Immunantwort und eine systemische Entzündung mit der Entwicklung zahlreicher neurologischer Erkrankungen wie schweren depressiven Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht¹⁰. Es wurde festgestellt, dass eine pflanzliche Ernährung zusammen mit anderen Lebensstilinterventionen die kognitiven und funktionellen Fähigkeiten bei älteren Menschen verbessert 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Es wurde festgestellt, dass bestimmte elektrophile Moleküle, die zu Triterpenen und Polyphenolen gehören, Entzündungsreaktionen sowohl in vitro- als auch in vivo-Modellen ^{modulieren 12}. Zum Beispiel stören natürliche Verbindungen, die α,β-ungesättigtes Carbonyl (z. B. Curcumin, Zimtaldehyd) oder Isothiocyanatgruppe (z. B. Sulforaphan) enthalten, die Toll-like-Rezeptor-4 (TLR4) -Dimerisierung, die die nachgeschaltete Synthese von proinflammatorischen Zytokinen in einer murinen Interleukin-3-abhängigen Pro-B-Zelllinie hemmt^12,22 . Epidemiologische Beweise deuten stark darauf hin, dass diätetische Phytochemikalien, die in komplexen Lebensmittelmatrizen vorhanden sind, auch eine brauchbare Quelle für neue Arzneimittelleitungen darstellen^{können 6}.

Eines der Haupthindernisse bei der Identifizierung biologisch aktiver Moleküle in Pflanzenextrakten, einschließlich pflanzlicher Lebensmittel, ist die Komplexität der untersuchten Proben. Traditionell werden die einzelnen Verbindungen isoliert, gereinigt und anschließend auf biologische Aktivität getestet. Dieser Ansatz führt in der Regel zur Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen. Phänotypische Wirkstoffforschungsansätze ohne definiertes molekulares Ziel beruhen auf der bio-geführten Fraktionierung komplexer Gemische²³. Bei diesem Ansatz wird ein Extrakt in weniger komplexe Unterfraktionen fraktioniert, die anschließend in phänotypischen Assays getestet werden. Die Isolierung und Reinigung von Wirkstoffen wird durch die im Assay verifizierte biologische Aktivität geleitet. Die Kenntnis der Identität eines spezifizierten Wirkstoffziels kann die Identifizierung pharmakologisch aktiver Verbindungen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind, erheblich beschleunigen. Diese Ansätze basieren in der Regel auf der Immobilisierung des molekularen Ziels, beispielsweise eines Enzyms, auf einer festen Oberfläche, wie magnetischen Perlen²³. Die immobilisierten Targets werden anschließend in den Screening-Experimenten verwendet, was zur Isolierung von Verbindungen führt, die mit dem Target interagieren. Während dieser Ansatz bei der Identifizierung von Verbindungen, die auf zytosolische Proteine abzielen, umfassend verwendet wurde, wurde er bei der Identifizierung von Chemikalien, die mit Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, ^{seltener angewendet23.} Eine zusätzliche Herausforderung bei der Immobilisierung von TMPs ergibt sich aus der Tatsache, dass die Aktivität des Proteins von seiner Wechselwirkung mit Zellmembranphospholipiden und anderen Molekülen in der Doppelschicht wie Cholesterin^23,24 abhängt. Es ist wichtig, diese subtilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und ihrer nativen Phospholipid-Doppelschichtumgebung zu erhalten, wenn versucht wird, das Transmembranziel zu immobilisieren.

In der Zellmembranaffinitätschromatographie (CMAC) werden Zellmembranfragmente und nicht gereinigte Proteine auf den stationären Phasenpartikeln der künstlichen Membran (IAM)^{immobilisiert 23}. Stationäre IAM-Phasen werden durch kovalente Bindung von Phosphatidylcholinanaloga an Siliciumdioxid hergestellt. In jüngster Zeit wurden neuartige Klassen von stationären IAM-Phasen entwickelt, in denen freie Amin- und Silanolgruppen endgekappt sind (IAM. PC. DD2-Partikel). Während der CMAC-Säulenvorbereitung werden Zellmembranfragmente durch Adsorption auf die Oberfläche von IAM-Partikeln immobilisiert.

CMAC-Säulen wurden bisher verwendet, um verschiedene Klassen von TMPs zu immobilisieren, einschließlich Ionenkanäle (z. B. Nikotinrezeptoren), GPCRs (z. B. Opioidrezeptoren), Proteintransporter (z. B. p-Glykoprotein) usw. ²⁴. Die immobilisierten Proteintargets wurden bei der Charakterisierung der Pharmakodynamik (z. B. Dissoziationskonstante, Kd) oder der Bestimmung der Bindungskinetik (k_on und k_off) von niedermolekularen Liganden, die mit dem Ziel interagieren, sowie bei der Identifizierung potenzieller neuer Wirkstoff-Leads in komplexen Matrizen verwendet²⁴ . Hier stellen wir die Herstellung von CMAC-Säulen mit dem immobilisierten Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich als brauchbares Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems herausgestellt hat.

Frühere Studien zeigten, dass die Aktivierung des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) / TrkB-Signalwegs mit der Verbesserung bestimmter neurologischer Erkrankungen wie AD oder schwerer depressiver Störung^{verbunden ist 25,26,27,28}. Es wurde berichtet, dass BDNF-Spiegel und seine Rezeptor-TrkB-Expression bei AD abnehmen, und ähnliche Reduktionen beeinträchtigen die Hippocampus-Funktion in Tiermodellen von AD²⁹. Verminderte BDNF-Spiegel wurden im Serum und im Gehirn von ^{AD-Patienten berichtet 30,31,32}. Es wurde festgestellt, dass Tau-Überexpression oder Hyperphosphorylierung die BDNF-Expression in primären Neuronen und AD-Tiermodellen herunterreguliert^33,34,35. Darüber hinaus wurde berichtet, dass BDNF in vitro und in vivo³⁶ schützende Wirkungen auf die β-Amyloid-induzierte Neurotoxizität hat. Es wurde gezeigt, dass die direkte BDNF-Verabreichung in das Rattengehirn das Lernen und das Gedächtnis bei kognitiv beeinträchtigten Tieren^{erhöht 37}. BDNF/TrkB erwies sich als gültiges Ziel für die Linderung neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen, einschließlich AD^28,38. Die Ausrichtung auf den BDNF/TrkB-Signalweg für die Entwicklung von Therapien bei AD wird möglicherweise unser Verständnis der Krankheit^{verbessern 39}. Leider kann BDNF selbst wegen seiner schlechten pharmakokinetischen Eigenschaften und Nebenwirkungen nicht als Behandlung verwendet^{werden 40}. Kleine Molekülaktivatoren von TrkB/BDNF-Signalwegen wurden als potenzielle TrkB-Liganden^41,42,43 untersucht. Unter den getesteten niedermolekularen Agonisten wurde gezeigt, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) den BDNF / TrkB-Signalweg ^41,44,45,46 aktiviert. Ein Derivat von 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromen-7,8-diylbis(methylcarbamat)) wird derzeit als mögliches Medikament für AD⁴⁷ in Betracht gezogen. Kürzlich wurde gezeigt, dass mehrere Antidepressiva direkt an TrkB binden und die BDNF-Signalgebung fördern, was die Bedeutung der Verfolgung von TrkB als gültiges Ziel zur Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen^{weiter unterstreicht 48}.

Das Protokoll beschreibt den Prozess der Zusammenstellung der funktionalen TrkB-Spalte und der TrkB-NULL-Negativkontrollsäule. Die Säulen werden mit einem bekannten Naturprodukt kleinmolekularer Liganden charakterisiert: 7,8-DHF. Darüber hinaus beschreiben wir den Prozess des Screenings komplexer Matrizen am Beispiel von Pflanzenextrakt zur Identifizierung von Verbindungen, die mit TrkB interagieren.

Protocol

1. Zellkultur von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen (TrkB- und TrkB-NULL-Zelllinien (parentale) Zelllinien) HINWEIS: Zelllinien (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) und SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 wurden von Kerafast gekauft. Kultivierte Zellen werden als Quelle der Transmembranrezeptoren verwendet, die für die Herstellung von CMAC-Säulen immobilisiert werden sollen. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie…

Representative Results

Nach dem Protokoll wurden zwei CMAC-chromatographische Säulen zusammengesetzt: eine mit den immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellmembranfragmenten mit überexprimiertem TrkB und eine mit SH-SY5Y TrkB-NULL-Zellmembranfragmenten. Die korrekt montierte CMAC-Säule ist in Abbildung 1 dargestellt, und die Schritte zur Immobilisierung von Zellmembranfragmenten sind in Abbildung 2 dargestellt. Seit der Immobilisierung von TrkB-Rezeptore…

Discussion

Die Identifizierung von Wirkstoffen, die in komplexen Mischungen spezialisierter Metaboliten vorhanden sind, ist eine sehr anspruchsvolle Aufgabe²³. Traditionell werden einzelne Verbindungen isoliert und ihre Aktivität in verschiedenen Assays getestet. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig und kostspielig und führt häufig zur Isolierung und Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen²³. Die derzeit verwendeten Hochdurchsatz-Screening…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA