Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol
Summary
Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Dendritik hücrelere (DC’ler) olan talep, immünoloji araştırmaları ilerledikçe giderek artmaktadır. Bununla birlikte, DC’ler tüm dokularda nadirdir. DC’leri izole etmek için geleneksel yöntem öncelikle büyük dozlarda (>10 ng / mL) granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör / interlökin-4 (GM-CSF / IL-4) enjekte ederek kemik iliği (BM) farklılaşmasını DC’lere indüklemeyi içerir ve prosedürü karmaşık ve pahalı hale getirir. Bu protokolde, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ortamında kültürlenmiş tüm BM hücreleri kullanılarak, 3-4 yarı kültür değişiminden sonra, fare başına 2.7 x 107 CD11c + hücresi (DC) (iki femur) % 80 -% 95 saflıkta toplanmıştır. Kültürde 10 gün sonra, CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonu artarken, hücre sayısı azaldı. Hücre sayısı 7 günlük kültürden sonra zirveye ulaştı. Dahası, bu yöntemin tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmesi sadece 10 dakika sürdü ve 1 haftalık kültürden sonra çok sayıda DC elde edildi.
Introduction
Dendritik hücreler (DC’ler), naif T hücrelerini aktive etmek ve bulaşıcı hastalıklara, alerji hastalıklarına ve tümör hücrelerine karşı spesifik sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını indüklemek için en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC’ler) 1,2,3. DC’ler doğuştan gelen bağışıklık ile adaptif immünite arasındaki birincil bağlantıdır ve immünolojik savunmada ve immün toleransın korunmasında önemli bir rol oynarlar. Son 40 yılda, birçok araştırmacı DC’lerin alt kümelerini ve inflamasyon ve bağışıklıktaki işlevlerini tanımlamaya çalışmıştır. Bu çalışmalara göre, DC’ler kemik iliği hücrelerinden miyeloid ve lenfoid soylar boyunca gelişir. Tümör aşıları son yıllarda önemli kilometre taşları kazanmıştır ve umut verici bir geleceğe sahiptir. Mekanik olarak, tümör aşıları immün yanıtı modüle eder ve tümör antijenlerini kullanarak sitotoksik T lenfositleri aktive ederek tümör büyümesini önler. DC’lere dayanan aşı, tümör immünoterapisinde önemli bir rol oynamaktadır ve en umut verici anti-tümör tedavilerinden biri olarak tanımlanmıştır 1,4. Ek olarak, DC’ler yeni moleküler hedefli ilaçların ve immün kontrol noktası inhibitörlerinin testinde yaygın olarak kullanılmaktadır5.
Araştırmacılar, DC’lerin rolünü daha fazla incelemek için acilen çok sayıda yüksek saflıkta DC’ye ihtiyaç duymaktadır. Bununla birlikte, DC’ler çeşitli dokularda ve kanda nadirdir ve insanlarda ve hayvanlarda kan hücrelerinin sadece% 1’ini oluşturur. Kemik iliği dendritik hücrelerinin in vitro kültürü (BMDC), büyük miktarlarda DC hücresi elde etmek için önemli bir yöntemdir. Bu arada, kemik iliğinden DC’ler üretmek için Lutz protokolü araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır6. Protokol DC hücrelerinin elde edilmesinde etkili olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonlarda sitokinlerin eklenmesini ve kırmızı kan hücrelerinin lizisini içeren karmaşık ve pahalıdır.
Bu çalışmada, hemen hemen tüm kemik iliği hücrelerini fare kemik iliğinden (BM) izole etmek ve in vitro 7-9 günlük inkübasyondan sonra BMDC’ye farklılaşmayı indüklemek için daha düşük GM-CSF ve IL-4 konsantrasyonu ile bir yöntem sunulmuştur. Bu prosedür, neredeyse tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmek ve bunları tam bir ortamda askıya almak için sadece 10 dakika sürer. Kısacası, bu araştırmada BMDC için verimli ve uygun maliyetli bir kültürleme yöntemi sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsanlar ve fareler, klasik DC’ler (cDC1’ler ve cDC2’ler dahil cDC’ler) plazmasitoid DC’ler (pDC’ler) ve monosit kaynaklı DC’ler (MoDC’ler) 9,10,11 dahil olmak üzere farklı DC alt kümelerine sahiptir. Genel olarak, cDC1’lerin hücre içi patojenlere ve kansere karşı sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını düzenlediği ve cDC2’lerin hücre dışı patojenlere, parazitlere ve alerjenlere karşı immün yanıtları düze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Tianjin Bilim ve Teknoloji Planı Programı (20JCQNJC00550), Tianjin Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Projesi (TJWJ202021QN033 ve TJWJ202021QN034) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
