Agravamento da Isquemia do Miocárdio sobre exposição de matéria particulada no modelo animal de aterosclerose

Summary

Este protocolo descreve um modelo animal composto com exposição a material particulado (PM) que agrava a isquemia miocárdica com aterosclerose.

Abstract

Os problemas de saúde causados pela poluição do ar (especialmente a poluição das partículas) estão recebendo cada vez mais atenção, especialmente entre pacientes com doenças cardiovasculares, o que agrava transtornos complicados e causa mau prognóstico. O modelo simples de isquemia miocárdica (MI) ou material particulado (PM) é inadequado para tais estudos de doenças com múltiplas causas. Aqui, foi descrito um método para a construção de um modelo composto que combina exposição à PM, aterosclerose e isquemia do miocárdio. Os camundongos apoE^-/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura por 16 semanas para desenvolver aterosclerose, a instilação traqueal da suspensão padrão pm foi realizada para simular a exposição pulmonar da PM, e a artéria coronária descendente anterior esquerda foi ligalada uma semana após a última exposição. A instilação traqueal da PM pode simular exposição pulmonar aguda, reduzindo significativamente o custo do experimento; a clássica ligatração da artéria descendente anterior com intubação traqueal não invasiva e um novo dispositivo de expansão auxiliar podem garantir a taxa de sobrevivência do animal e reduzir a dificuldade da operação. Este modelo animal pode simular razoavelmente as alterações patológicas do infarto do miocárdio agravado pela poluição do ar e fornecer referência para a construção de modelos animais relacionados a estudos envolvendo doenças com múltiplas causas.

Introduction

A poluição do ar tem sido associada à alta mortalidade por todas as causas e contribuiu com uma carga significativa da doença mais do que a soma da poluição da água, poluição do solo e exposição ocupacional¹. Um relatório da OMS revelou que a poluição atmosférica ao ar livre causou 4,2 milhões de mortes prematuras em ambas as cidades e áreas rurais em todo o mundo em 2016². 91% das pessoas em todo o mundo vivem em locais onde a qualidade do ar excede os limites^de diretrizes da OMS 2. Além disso, a matéria particulada fina (PM) (≤2,5 μm de diâmetro, PM_2,5) é reconhecida como a ameaça mais significativa de poluição do ar à saúde pública global³, especialmente para as pessoas que vivem em cidades de países de baixa renda e de renda média.

Os efeitos adversos da poluição do ar sobre doenças cardiovasculares merecem mais atenção. Estudos anteriores mostraram que a PM leva a um aumento do risco de doenças cardiovasculares (DCV)⁴. A exposição a altas concentrações de partículas ultrafinas por várias horas pode levar ao aumento da mortalidade por infarto do miocárdio. Para pessoas com histórico de infarto do miocárdio, a exposição a partículas ultrafinas pode aumentar significativamente o risco de recidiva⁵. Além disso, geralmente é aceito que a exposição à PM acelera a progressão da aterosclerose⁶.

Para a pesquisa médica, é crucial selecionar um modelo animal adequado. Modelos animais de aterosclerose simples⁷, isquemia miocárdica modelos^{animais 8}, e modelos animais de exposição PM⁹ já existem. O camundongo ApoE^−/− (apolipoproteína E nocauteada) é um modelo tradicional de camundongos usado em estudos de aterosclerose. A capacidade de limpar lipoproteínas plasmáticas em camundongos ApoE^−/− é severamente prejudicada. A alimentação alimentar com alto teor de gordura causaria aterosclerose grave, assemelhando-se à dependência dietética de doenças cardíacas ateroscleróticas observadas em humanos⁷. A ligadura da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) é um método clássico para induzir o evento isquêmico ^8,10. A infusão traqueal tem sido usada em muitas pesquisas e se destaca dos modelos de exposição^11,12 por causa de sua melhor simulação e menor custo.

No entanto, modelos animais de doença única têm limitações significativas na pesquisa científica. A isquemia miocárdica induzida apenas pela ligadura LAD não é simulada na situação real. No estado natural, a isquemia do miocárdio é geralmente causada pela ruptura da placa e artérias coronárias bloqueadas¹³. Pacientes com cardiomiopatia isquêmica geralmente têm lesões básicas ateroscleróticas¹³. Há também metabolismo lipídico anormal e reações inflamatórias no corpo¹⁴. Portanto, a isquemia causada por fatores físicos ou em condições naturais tem diferentes manifestações patológicas. Estudos existentes têm demonstrado que o infarto e inflamação em modelos de isquemia miocárdica com aterosclerose são mais graves^15,16. A exposição da PM pode agravar ainda mais a aterosclerose e isquemia do miocárdio, induzindo inflamação e estresse oxidativo¹. Três fatores geralmente coexistem no estado natural, de modo que a situação real poderia ser melhor simulada usando um modelo composto.

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo animal de isquemia miocárdica (MI) combinando aterosclerose (AS) e exposição aguda de PM. Os camundongos apoE^−/− foram alimentados com uma dieta rica em gordura para induzir aterosclerose. A exposição pulmonar da PM foi imitada pela suspensão da PM pingando através da traqueia. A ligadura do LAD em camundongos foi usada para induzir isquemia miocárdica. Esses métodos foram combinados e otimizados para simular melhor o estado da doença e melhorar a taxa de sobrevivência dos animais. Nenhuma grande unidade de exposição ou máquina de anestesia a gás é necessária, facilitando o desempenho do experimento. Este modelo pode ser usado para estudar o impacto da exposição da PM na poluição do ar na aterosclerose e cardiomiopatia isquêmica e realizar pesquisas sobre novos fármacos desenvolvidos para tratar doenças com fatores tão complexos.

Protocol

Todas as atividades animais descritas aqui foram aprovadas pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de MateriaMedim Chinês, Academia chinesa de Ciências Médicas Chinesas. Foram utilizados para o estudo camundongos machos ApoE−/− (C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade). 1. Preparação experimental Preparar anestésicos tribromoetanol (15 mg/mL): dissolver 0,75 g de tribromoetanol em 1 mL de álcool tert-amilo (ver Tabela de Materiais)…

Representative Results

Os camundongos foram eutanizados 24 h após a ligadura da artéria coronária, e o sangue foi coletado após anestesia. Os camundongos foram anestesiados por tribromoetanol (conforme o passo 3.2), e a amostra de sangue foi coletada do seio retroorbital. O coração foi colhido, e o grau de Isquemia foi examinado por 2,3,5-Triphenyltetrazolium Cloreto (TTC) (Figura 1). Os tecidos normais ficam vermelhos quando o TTC reage com desidrogenase de succinato, enquanto os tecidos is…

Discussion

O estabelecimento de um modelo animal composto é ligeiramente diferente do modelo MI único. Manter uma alta taxa de sobrevivência é um desafio no desenvolvimento do modelo composto. A gravidade da aterosclerose em camundongos ApoE^−/− se tornará mais severa com a extensão do tempo de alimentação de alta gordura⁷, e a fraqueza dos camundongos leva ao aumento da mortalidade. Portanto, é necessário monitorar a condição dos camundongos durante o experimento continuamente e aj…

Materials

2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
75% alcohol disinfectant
Animal ventilator	Shanghai Alcott Biotech	ALC-V8S
Cotton swabs			Sterile
Cotton swabs for babies			Sterile , Approximately 3 mm in diameter
Culture Dish	Corning	430597	150 mm x 25 mm
Diesel Particulate Matter	National Institute of Standards Technology	1650b
Dissection board			About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size
High-fat diet for mice			Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79%
Iodophor disinfectant
LED spotlight			5 V, 3 W,with hoses and clamps
Medical silk yarn ball	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	0-0
Medical tape	3M	1527C-0
Micro Vascular Hemostatic Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	W40350
Needle Holders	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JC32010
Normal saline
Ophthalmic Scissors	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	Y00040
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1080
Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory	JD1060
Pipet Tips	Axygen	T-200-Y-R-S	0-200 μL
Pipette	eppendorf	3121000074	100 uL
Safety pin			Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools
Small Animal I.V. Cannulas	Baayen healthcare suzhou	BAAN-322025	I.V CATHETER 22FG x 25 MM
Suture needle with thread	Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd.	–	6-0,Nylon line
Suture needle with thread	JinHuan Medical	F503	5-0
Syringe			1 mL
Tert-amyl alcohol
Zoom-stereo microscope	Mshot	MZ62