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생물학

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell’attività enzimatica metabolica in tempo reale e un’analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Abstract

Il metabolismo è alla base di importanti processi nella vita cellulare. Caratterizzare il funzionamento delle reti metaboliche nei tessuti viventi fornisce informazioni cruciali per comprendere il meccanismo delle malattie e progettare trattamenti. In questo lavoro, descriviamo procedure e metodologie per studiare l’attività metabolica in cellula in un cuore di topo perfuso retrogradamente in tempo reale. Il cuore è stato isolato in situ, in concomitanza con l’arresto cardiaco per ridurre al minimo l’ischemia miocardica ed è stato perfuso all’interno di uno spettrometro di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mentre nello spettrometro e sotto perfusione continua, il [1-13 C]piruvato iperpolarizzato è stato somministrato al cuore, e i successivi tassi di produzione iperpolarizzati [1-13 C]lattato e [13C] bicarbonato sono serviti a determinare, in tempo reale, i tassi di produzione di lattato deidrogenasi e piruvato deidrogenasi. Questa attività metabolica del [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stata quantificata con spettroscopia NMR in un modello libero utilizzando l’approccio di acquisizione selettiva di saturazione-eccitazione del prodotto. 31 La spettroscopia P è stata applicata tra le acquisizioni iperpolarizzate per monitorare l’energetica cardiaca e il pH. Questo sistema è utile in modo univoco per studiare l’attività metabolica nel cuore di topo sano e malato.

Introduction

Le alterazioni del metabolismo cardiaco sono associate a una varietà di cardiomiopatie e spesso costituiscono la base dei meccanismi fisiopatologici sottostanti1. Tuttavia, ci sono numerosi ostacoli allo studio del metabolismo nei tessuti viventi, poiché la maggior parte dei saggi biochimici richiede l’omogeneizzazione del tessuto e la lisi cellulare e / o il tracciamento radioattivo. Pertanto, vi è una pressante necessità di nuovi strumenti per studiare il metabolismo miocardico nei tessuti viventi. La risonanza magnetica (MR) dei substrati iperpolarizzati marcati con 13C consente misurazioni in tempo reale del metabolismo nei tessuti viventi2, senza l’uso di radiazioni ionizzanti, aumentando il rapporto segnale-rumore MR (SNR) dei siti marcati di diversi ordini di grandezza3. Qui, descriviamo una configurazione sperimentale, un approccio di acquisizione e un approccio analitico per studiare il metabolismo rapido nel cuore di topo isolato e, in parallelo, presentare indicatori di energetica generale del tessuto e acidità. Il pH cardiaco è un indicatore prezioso, poiché l’equilibrio acido-base viene interrotto nelle prime fasi di malattie cardiache e condizioni come ischemia miocardica, ipertrofia disadattiva e insufficienza cardiaca6.

La produzione iperpolarizzata di [1-13 C]lattato e [13 C]bicarbonato da [1-13C]piruvato iperpolarizzato aiuta a determinare i tassi di produzione di lattato deidrogenasi (LDH) e piruvato deidrogenasi (PDH). La maggior parte degli studi precedenti condotti utilizzando substrati iperpolarizzati nel cuore isolato del roditore ha utilizzato modelli cinetici complessi per derivare l’attività enzimatica di LDH e PDH, o ha riportato i rapporti di intensità del segnale del prodotto iperpolarizzato su un substrato senza calcolare i tassi effettivi di attività enzimatica 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Qui, abbiamo utilizzato l’approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto 15, che consente il monitoraggio dell’attività enzimatica in modo privo di modelli15,16. In questo modo sono stati determinati i tassi enzimatici assoluti (cioè il numero di moli di prodotto prodotte per unità di tempo). 31 La spettroscopia P è stata utilizzata per osservare i segnali di fosfato inorganico (Pi), fosfocreatina (PCr) e adenosina trifosfato (ATP). Un’analisi multiparametrica è stata utilizzata per caratterizzare la distribuzione del pH del cuore, come dimostrato dallo spostamento chimico eterogeneo nel segnale Pi del tessuto.

Il cuore di topo perfuso retrogradamente (Langendorff heart)17,18,19 è un modello ex vivo per il cuore pulsante intatto. In questo modello, la vitalità cardiaca e il pH sono conservati per almeno 80 minuti20 e ha mostrato un potenziale di recupero dopo una lesione ischemica prolungata21,22. Tuttavia, la variabilità involontaria durante la microchirurgia può portare a variabilità nella vitalità del tessuto attraverso i cuori. Studi precedenti hanno riportato il deterioramento di questo cuore nel tempo19; Ad esempio, è stata osservata una riduzione della funzione contrattile del 5% -10% all’ora18. Il segnale dell’adenosina trifosfato (ATP) ha precedentemente dimostrato di riferire sullo stato energetico miocardico e sulla vitalità23. Qui, abbiamo notato che il cuore perfuso può occasionalmente mostrare una variabilità involontaria nei livelli di vitalità, come dimostrato dal contenuto di ATP, nonostante il fatto che abbiamo avuto una perfusione ininterrotta e un apporto di ossigeno. Dimostriamo qui che normalizzare i tassi di LDH e PDH al contenuto di ATP del cuore riduce la variabilità inter-cardiaca in questi tassi.

Nel seguente protocollo, descriviamo la procedura chirurgica utilizzata per l’incannulamento cardiaco, l’isolamento e la conseguente perfusione nello spettrometro NMR. Da notare, altri approcci chirurgici volti a isolare e perfondere il cuore di topo sono stati descritti prima di24,25.

Vengono descritte anche le metodologie utilizzate per l’acquisizione dei dati relativi ai tassi enzimatici nel cuore pulsante (utilizzando la spettroscopia 13 C e iperpolarizzato [1-13C]piruvato) e la vitalità e l’acidità del cuore (utilizzando la spettroscopia NMR 31P). Infine, vengono spiegate le metodologie analitiche per determinare le attività enzimatiche metaboliche e la vitalità e l’acidità dei tessuti.

Protocol

Il comitato etico congiunto (IACUC) dell’Università ebraica e dell’Hadassah Medical Center ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-19-15827-1). 1. Preparazione del tampone Krebs-Henseleit Un giorno prima dell’esperimento, preparare una versione modificata del buffer Krebs-Henseleit (KHB)26. Inizialmente, sciogliere 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO…

Representative Results

Gli spettri 31P registrati da un cuore di topo perfuso con KHB e dal solo tampone sono mostrati nella Figura 1A. I segnali di α-, β- e γ-ATP, PCr e Pi sono stati osservati nel cuore. Il segnale Pi era composto da due componenti principali: nel campo superiore (lato sinistro del segnale), il segnale Pi era principalmente dovuto al KHB ad un pH di 7,4; nel campo inferiore (lato destro del segnale), il segnale Pi era più ampio e meno omogeneo a causa dell’ambiente più acido. Que…

Discussion

Dimostriamo una configurazione sperimentale progettata per studiare il metabolismo iperpolarizzato [1-13C] del piruvato, l’energetica dei tessuti e il pH in un modello di cuore di topo isolato.

I passaggi critici all’interno del protocollo sono i seguenti: 1) garantire che il pH del tampone sia 7,4; 2) garantire che tutti i componenti del buffer siano inclusi; 3) evitare la coagulazione del sangue nei vasi cardiaci mediante iniezioni di eparina; 4) evitare il danno ischemico al cuor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla Israel Science Foundation nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 1379/18; la borsa di studio Jabotinsky del Ministero israeliano della scienza e della tecnologia per le scienze applicate e ingegneristiche per i dottorandi diretti n. 3-15892 per DS; e il programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
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Keywords: Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
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