이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.
세포 수축력 생성은 거의 모든 세포가 공유하는 근본적인 특성입니다. 이러한 수축력은 적절한 발달에 결정적이며, 세포 및 조직 수준에서 기능하며, 신체의 기계적 시스템을 조절합니다. 수많은 생물학적 과정은 운동성, 접착 및 단일 세포의 분열뿐만 아니라 심장, 방광, 폐, 장 및 자궁과 같은 기관의 수축 및 이완을 포함하여 힘에 의존합니다. 적절한 생리 기능을 유지하는 것이 중요하다는 점을 감안할 때, 세포 수축성은 과장되거나 중단 될 때 질병 과정을 유발할 수 있습니다. 천식, 고혈압, 조산, 섬유성 흉터 및 저활동 방광은 모두 세포 수축력의 적절한 조절로 잠재적으로 완화 될 수있는 기계적으로 구동되는 질병 과정의 예입니다. 여기에서는 형광 표지 엘라스토머 수축성 표면(FLECS)으로 알려진 새로운 마이크로플레이트 기반 수축성 분석 기술을 활용하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시하며, 이는 대규모로 확장된 방식으로 단일 세포 수축성에 대한 단순화되고 직관적인 분석을 제공합니다. 본원에서, 우리는 단지 하나의 FLECS 분석 마이크로플레이트를 이용하는 간단한 절차에서 일차 인간 방광 평활근 세포의 수축에 대한 두 개의 수축 억제제의 효과를 기술하는 두 개의 여섯 점 용량-반응 곡선을 얻기 위한 단계적 프로토콜을 제공하여, 상기 방법의 사용자에게 적절한 기술을 입증한다. FLECS 기술을 사용하여 기본 생물학적 실험실 및 형광 현미경 시스템을 갖춘 모든 연구자는이 근본적이지만 정량화하기 어려운 기능적 세포 표현형을 연구하여 힘 생물학 분야로의 진입 장벽을 효과적으로 낮추고 수축성 세포력의 표현형 스크리닝을 효과적으로 수행 할 수 있습니다.
세포 생성 된 기계적 힘은 창자, 방광, 심장 및 기타와 같은 신체 전체의 다양한 기관에서 적절한 기능에 필수적입니다. 이러한 기관은 내부 항상성 상태를 유지하기 위해 세포 수축 및 이완의 안정적인 패턴을 생성해야합니다. 비정상적인 평활근 세포 (SMC) 수축은 예를 들어, 장 평활근 수축의 비정상적인 패턴을 특징으로하는 장 운동 장애1뿐만 아니라 과민성2 또는 저활동 방광3의 비뇨기과 상태를 포함한 다양한 장애의 발병으로 이어질 수 있습니다. 기도 내에서 불규칙한 수축 패턴을 보이는 SMC는 천식 과민 반응을 유발할 수 있으며4 잠재적으로 기도를 조이고 폐로 유입되는 산소의 공기 흐름을 감소시킬 수 있습니다. 또 다른 광범위한 신체 상태 인 고혈압은 혈관 내 평활근 수축의 변동으로 인해 발생합니다5. 분명히 세포와 조직 내의 수축 메커니즘은 치료 옵션이 필요한 질병으로 이어질 수 있습니다. 이러한 조건은 분명히 세포의 기능 장애 수축 행동에서 비롯되기 때문에 잠재적 인 약물 후보를 스크리닝 할 때 세포 수축 기능 자체를 측정하는 것이 논리적이고 필요하게됩니다.
세포 수축력을 연구하는 도구의 필요성을 인식하여 견인력 현미경 (TFM)6, 마이크로 패턴 TFM7, 플로팅 겔 분석8 및 엘라스토머 마이크로 포스트 분석9을 포함한 여러 정량적 수축 분석 방법이 학술 연구자에 의해 개발되었습니다. 이러한 기술은 수많은 연구에서 단일 접시 형식뿐만 아니라 다중 웰 플레이트 형식으로 활용되었으며 3 차원 힘 측정에도 제안되었습니다10,11,12,13,14. 이러한 기술은 광범위한 세포력 생물학 분야에서 선구적인 연구를 가능하게 했지만, TFM 기질을 제작할 수 있는 능력, TFM 변위 지도를 해결하기 위해 복잡하고 직관적이지 않은 알고리즘을 적절하게 적용할 수 있는 능력, 그리고 스테이지에서 샘플 제거 전후에 촬영한 이미지를 등록할 수 있는 비교적 정밀한 현미경 시스템(세포 해리용)과 같은 특정 기능과 자원을 보유한 실험실로 크게 제한되었습니다. 따라서, 훈련받지 않은 연구자의 경우, 이러한 기술을 적용하기위한 광범위한 요구 사항을 감안할 때 이러한 방법을 사용하는 진입 장벽이 상당히 높을 수 있습니다. 또한 많은 기존 기술(40배 이상의 목표)에 필요한 이미징 해상도는 실험 처리량을 크게 제한할 수 있는 반면, 대량 측정 기술은 이상치 세포의 기여도를 감추고 경미한 수축성 차이의 발견을 방지할 수 있습니다. 참고로, 저자가 알고있는 한, 낮은 처리량 및 반 정량적 부유 겔 분석 접근법 만이 연구자가 사용할 수있을 정도로 충분히 성숙했습니다 (그림 1 참조).
그림 1: FLECS Technology 방법의 전체 개략도 . (A) 세포는 유리에 의해 지지되는 얇은 엘라스토머 층에 공유적으로 매립되는 접착 단백질 마이크로패턴에 부착된다. (B) 다양한 가능한 마이크로패턴 형상의 탑뷰와 ‘X’ 자형 마이크로패턴을 수축시키는 셀의 폭발. (C) 형광 마이크로패턴의 오버레이 및 수축 세포의 위상차 이미지. (D) 단일 계약 셀의 시간 코스 이미지. 스케일 바 = 25 μm. 이 수치는 Pushkarsky et al15의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
최근 마이크로기술의 발전에 따라, 저자들은 FLECS(형광으로 라벨링된 엘라스토머 수축성 표면)라고 불리는 수십만 개의 세포에서 단일 세포 수축을 정량적으로 측정할 수 있는 마이크로플레이트 기반 기술을 개발했다.15,16,17,18,19,20 TFM의 대안으로. 이 접근법에서, 형광 단백질 마이크로패턴은 세포가 직관적이고 측정 가능한 방식으로 그들에게 견인력을 가할 때 변형되고 수축되는 연질 필름에 내장된다. 중요하게도, 단백질 마이크로패턴은 세포 위치, 형상 및 확산 영역을 제한하여 균일한 시험 조건을 유도한다. 이를 통해 치수 변화만을 기반으로 간단한 측정이 가능하며, 이는 4x 배율 이미지에서도 공간적으로 고도로 분해됩니다. 이 방법에는 브라우저 기반 이미지 분석 모듈이 포함되어 있으며 섬세한 취급 절차나 신탁 마커 등록 없이도 수축성 세포력을 간단하게 분석할 수 있으므로 기본 세포 배양 시설과 낮은 배율의 간단한 형광 현미경을 갖춘 모든 연구자가 조작할 수 있어야 합니다(그림 2 ). 선반 준비 및 상용화 된이 기술은 최종 사용자를 염두에두고 설계되었으며 실험실 과학자가 세포 힘 생물학을 연구 할 수있는 진입 장벽을 줄이는 것을 목표로합니다.
도 2: 단일 세포 수축성 검정을 위한 24-웰 플레이트 포맷의 개략도. 이 포맷은 본원에 기술된 실험에 사용되었고, 기사의 비디오 부분에 묘사되었다. 배율 막대 = 25μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 연구에서는 일차 방광 평활근 세포의 세포 수축성에 대한 힘 조절 약물의 영향을 정량화하기 위해 FLECS Technology 플랫폼의 24 웰 플레이트 형식을 적용하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 범용 프로토콜은 다양한 다른 시간 척도, 세포 유형 및 관심있는 치료 조건을 설명하기 위해 필요에 따라 적응 및 수정 될 수 있으며 힘 생물학의 다른 질문에 대답하도록 확장 될 수 있습니다.
다양한 처리 조건 하에서 한 번에 수십만 개의 세포에서 수축을 정량적으로 측정하고 표준 현미경 기기 만 사용하는이 단순화 된 방법은 연구자가 세포 힘 생물학을 연구 할 수있는 전통적인 TFM에 대한 접근 가능한 대안을 제공합니다. 제시된 기술은 규칙적으로 형상화된 형광 마이크로패턴의 변화를 분석함으로써 세포 수축의 시각적 표시를 제공하기 때문에, 임의의 주어진 세포에 의해 생성된 수축의 크기는 직관적으로 이해된다 – 마이크로패턴이 작을수록, 세포에 의해 가해지는 수축력이 클수록.
특히, 마이크로패턴(세포 수축성을 조절하는 것으로 알려진 모든 인자22,23,24)을 포함하는 형태, 확산 면적 및 부착 분자와 같은 인자들에 대한 제어를 제공함으로써, 제시된 기술은 세포 수축 연구의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 추가적인 변수들을 체계적으로 제거한다.
이 실험에서는 10 kPa 강성을 겔에 사용하고 70 μm (대각선 길이) 마이크로 패턴을 사용하여 IV 형 콜라겐으로 구성했습니다. 이들 파라미터 외에, 접착 분자는 다양한 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴 및 다른 세포외 매트릭스 (ECM)로 대체될 수 있다. 젤의 강성은 0.1kPa까지 그리고 MPa 범위까지 조정할 수 있습니다. 마이크로 패턴 지오메트리는 ~ 5 μm의 최소 피쳐 크기로 모든 형상으로 de novo를 설계 할 수 있습니다. 이들 파라미터는 분리되고, 특정 생물학적 맥락에 대해 독립적으로 최적화될 수 있다.
이 기술은 다양한 평활근 세포 유형 (일차 인간 방광, 장, 기관지, 기관지, 자궁, 대동맥 및 동맥), 중간엽 줄기 세포 및 그 분화 된 자손, 다양한 섬유 아세포 (폐, 진피 및 심장), 근섬유아세포 및 내피 세포를 포함한 중간엽 표현형의 고접착성 및 수축성 세포 유형과 호환되도록 광범위하게 입증되었습니다. 또한, 단핵구 유래 대식세포는 또한 마이크로패턴, 특히 마이크로패턴이 공지된 옵소닌으로 구성되는 경우 마이크로패턴에 대해 큰 측정가능한 식작용을 생성할 것이다. 다양한 암 라인이 또한 상기 방법을 사용하여 검정될 수 있다.
이 방법은 T 세포 및 호중구와 같이 상대적으로 작은 세포 또는 주로 상피 표현형을 갖는 세포 유형과 함께 사용하기 위해 몇 가지 도전을 제기 할 수 있습니다. 이것의 주된 이유는이 방법이 측정 가능한 수축 신호를 생성하기 위해 마이크로 패턴을 통한 세포의 강한 접착력과 완전한 확산에 의존하기 때문입니다. 약하게 결합하거나, 서로 결합하거나, 완전히 퍼지지 않는 세포는 측정 가능한 수축 신호를 생성하지 않습니다. 비교적 드문 이러한 거동은 마이크로패턴 크기를 더 작게 조정하거나, 마이크로패턴 내에서 대체 접착 분자를 사용하여 이들 세포에서의 부착 및 확산을 더 잘 촉진함으로써 완화될 수 있다.
이 기술의 사용자는 상이한 성분, 성장 인자, 혈청 수준 및 pH 민감성이 상이한 세포에서 가변 거동을 유도할 수 있기 때문에, 관심있는 그들의 특정 세포 유형에 대해 상이한 가능한 세포 배양 배지 제형을 신중하게 평가해야 한다. 프로토콜의 최적화는 실험 워크플로의 크기 조정보다 선행되어야 하며, 미디어 구성 요소는 항상 신선하고 멸균되며 이전 배치와 일치해야 합니다.
궁극적으로, 단일 세포 분해능이 사용자의 목표에 필요하지 않거나 표적 세포 유형이 최소한의 확산 용량을 갖는 경우, 전통적인 TFM은 그러한 실험에 동등하거나 더 적합할 수 있다. 저자의 목표와 희망은이 도구가 세포 생물 학자들이 특히 자동화 된 고 처리량 표현형 약물 스크린의 맥락에서 세포 수축을 연구 할 수있는 추가 방법을 제공한다는 것입니다.
약물 스크린에서의 장래의 용도에 특정하여, 384-웰 FLECS 플레이트와 같은 더 높은 처리량 플레이트가 사용될 수 있다. 이러한 플레이트에서 많은 현미경의 4x 목표는 시야에서 단일 우물 전체를 포착하여 모든 세포 수축 반응을 포착 할 수 있습니다. 고처리량 이미징 시스템을 사용하면 약 5분 내에 전체 384웰 플레이트를 이미징할 수 있으므로 이 시스템은 다른 옵션보다 훨씬 빨라지므로 고처리량 표현형 약물 발견에 적합합니다. 실제로 저자는 자동화를 사용하여 ~ 50 개의 384 웰 플레이트 (총 19,000 웰 이상)에서 매주 약물 검사를 정기적으로 운영합니다.
The authors have nothing to disclose.
실험실 작업은 Forcyte가 연구 활동을 후원하는 UCLA 분자 공유 스크리닝 리소스 (MSSR)와 Forcyte Biotechnologies, Inc.가 상주 회사 인 California NanoSystems Institute (CNSI)의 Magnify Incubator의 지원으로 수행되었습니다. 저자는 요청시 모든 학술 연구원에게 Biodock.ai FLECS 분석 모듈에 대한 액세스 권한을 부여합니다. L.H.와 I.P.는이 일에 똑같이 기여했습니다.
Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |