Ex vivo og in vivo dyremodeller for mekaniske og kjemiske skader på hornhinneepitel

Summary

Her utvikles dyremodeller basert på mus og kanin for mekanisk og kjemisk skade på hornhinneepitel for å skjerme nye terapier og den underliggende mekanismen.

Abstract

Hornhinneskade på den okulære overflaten, inkludert kjemisk forbrenning og traumer, kan forårsake alvorlig arrdannelse, symblepharon, hornhinde limbale stamceller mangel, og resultere i en stor, vedvarende hornhinneepiteldefekt. Epiteldefekt med påfølgende hornhinnefortetning og perifer neovaskularisering gir irreversibel synssvekkelse og hindrer fremtidig behandling, spesielt keratoplastikk. Siden dyremodellen kan brukes som en effektiv legemiddelutviklingsplattform, utvikles modeller av hornhinneskade på musen og alkaliforbrenning til kaninhornhinneepitel her. New Zealand hvit kanin brukes i alkalibrenningsmodellen. Forskjellige konsentrasjoner av natriumhydroksid kan påføres det sentrale sirkulære området av hornhinnen i 30 sekunder under intramuskulær og aktuell anestesi. Etter rikelig isoton normal saltvannsirrigasjon ble gjenværende løst hornhinneepitel fjernet med hornhinneborr dypt ned til Bowmans lag innenfor dette sirkulære området. Sårheling ble dokumentert ved fluoresceinfarging under koboltblått lys. C57BL/6-mus ble brukt i den traumatiske modellen av murine hornhinneepitel. Murine sentralhornhinnen ble merket med et hudslag, 2 mm i diameter, og deretter debridert av en hornhinnerustringfjerner med en 0,5 mm burr under et stereomikroskop. Disse modellene kan prospektivt brukes til å validere den terapeutiske effekten av øyedråper eller blandede midler som stamceller, som potensielt letter hornhinneepitelregenerering. Ved å observere hornhindeopasitet, perifer neovaskularisering og konjunktival overbelastning med stereomikroskop og bildebehandlingsprogramvare, kan terapeutiske effekter i disse dyremodellene overvåkes.

Introduction

Den menneskelige hornhinnen består av fem hovedlag og spiller en sentral rolle i okulær brytning for å opprettholde synsstyrke og strukturell integritet for å beskytte intraokulært vev¹. Den ytre delen av hornhinnen er hornhinneepitelet, sammensatt av fem til seks lag med celler som sekvensielt skiller seg fra basalcellene og beveger seg oppover for å kaste fra den okulære overflaten¹. Sammenlignet med hornhinnen hos mennesker og New Zealand kaniner, har mushornhinnen en lignende hornhinnestruktur, men tynnere periferi enn den sentrale delen på grunn av redusert tykkelse i epitelet og stroma². På grunn av sin unike posisjon i det okulære optiske systemet, kan mange eksterne fornærmelser som mekanisk skade, bakteriell inokulasjon og kjemiske midler lett true epitelintegritet og videre føre til synstruende epiteldefekt, infeksiøs keratitt, hornhinnesmelting og til og med hornhindeperforering.

Selv om ulike terapeutiske midler, som smøremidler, antibiotika, antiinflammatoriske midler, autoserumprodukter og fostermembran, allerede har blitt brukt til å forbedre reepitelialisering og redusere arrdannelse, utvikles og testes fortsatt andre potensielle behandlingsmodaliteter som kan muliggjøre sårheling, redusere betennelse og undertrykke arrdannelse på forskjellige plattformer. Ulike dyremodeller for sårheling av hornhinneepitel har blitt foreslått, inkludert fjerning av hornhinneepitel med en hornhinnerustringfjerner i diabetisk mus³, lineære riper over hornhinneepitel fra mus med en steril 25 G nål for bakteriell inokulering⁴, trefinassistert fjerning av hornhinneepitelet ved hjelp av hornhinnen rustringfjerner⁵, epitelkautery over halvparten av hornhinnen og limbus⁶ , trefin-tilrettelagt kanin hornhinnen slitasje av en sløv skalpell blad⁷, og storfe hornhinnen skade ved flash frysing i flytende nitrogen⁸.

Annet enn mekanisk skade på hornhinnenepitel, er kjemiske midler også vanlige fornærmelser mot den okulære overflaten, spesielt sure og alkaliske midler. Natriumhydroksid (NaOH, 0,1-1 N for 30-60 s) er en av de vanligste kjemikaliene i murine og kaninmodeller av hornhinnekjemisk brenning 9,10,11,12,13. 100% etanol hadde også blitt påført hornhinnen i rotte kjemisk brenne modell, etterfulgt av ytterligere mekanisk skraping ved hjelp av et kirurgisk blad¹⁴. Siden vedlikehold av en sunn okulær overflate er avhengig av funksjonelle enheter, inkludert øyelokkene, Meibomian kjertler, lacrimal system, konjunktivene og hornhinnen, in vivo dyremodeller har noen fordeler over ex vivo dyrkede hornhinneepitelceller eller hornhinnen vev. I denne artikkelen er musemodellen av hornhinnen slitasje sår, og kaninmodellen av hornhinnen alkalibrenning demonstrert.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer i dyreforsøk ble godkjent av forskningsetisk komité ved Chang Gung Memorial Hospital og fulgte ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. 1. Ex vivo sårhelingsmodell av musehornhinneepitelet Forberedelse av museneAdministrer generell anestesi til C57BL / 6 mus ved intraperitoneal tilførsel av ketaminhydroklorid (80-100 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (5-10 mg / kg kroppsvekt). Sørg f…

Representative Results

Ex vivo sårhelingsmodell av hornhinneepitelet på mus:Etter in vivo debridement av hornhinneepitel fra mus med håndholdt hornhinnerustringfjerner, kan et mildt deprimert sentralt hornhinneområde med positiv fluoresceinflekk finnes i det sentrale 2 mm-området (figur 3A-B). Etter høsting av musens øyeboll ble den lett festet på en voksbelagt 48-brønns kulturplate uten betydelig rotasjon. Etter pro…

Discussion

Muse- og kaninmodeller av hornhinneskade gir en nyttig ex vivo og in vivo-plattform for overvåking av sårheling, testing av nye terapier og studier av underliggende mekanismer for sårheling og behandlingsveier. Ulike dyremodeller kan brukes til et kortsiktig eller langsiktig eksperiment, avhengig av formålet med forskningen. For eksempel, etter å ha opprettet en epiteldefekt på musehornhinnen in vivo, kan en begrenset epiteldefekt brukes til å overvåke flytende terapeutiske midler i et …

Materials

6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics