Модели на животных ex vivo и in vivo для механических и химических повреждений эпителия роговицы
Summary
Здесь модели животных, основанные на мышах и кроликах, разрабатываются для механического и химического повреждения эпителия роговицы для скрининга новых терапевтических средств и лежащего в их основе механизма.
Abstract
Повреждение роговицы глазной поверхности, включая химический ожог и травму, может вызвать серьезные рубцы, симблефарон, дефицит лимбальных стволовых клеток роговицы и привести к большому, стойкому дефекту эпителия роговицы. Дефект эпителия с последующим помутнением роговицы и периферической неоваскуляризацией приводят к необратимым нарушениям зрения и препятствуют будущему лечению, особенно кератопластике. Поскольку животная модель может быть использована в качестве эффективной платформы для разработки лекарств, здесь разрабатываются модели повреждения роговицы у мышей и щелочного ожога эпителия роговицы кролика. Новозеландский белый кролик используется в модели щелочного ожога. Различные концентрации гидроксида натрия можно наносить на центральную круговую область роговицы в течение 30 с под внутримышечной и местной анестезией. После обильного изотонического нормального орошения физиологическим раствором остаточный рыхлый эпителий роговицы удаляли с помощью заусенцев роговицы глубоко до слоя Боумена в пределах этой круглой области. Заживление ран было задокументировано окрашиванием флуоресцеина под кобальтовым синим светом. Мышей C57BL/6 использовали в травматической модели мышиного эпителия роговицы. Центральная роговица мыши была отмечена с помощью кожного пуансона диаметром 2 мм, а затем обработана средством для удаления ржавчины роговицы с заусенцем 0,5 мм под стереомикроскопом. Эти модели могут быть проспективно использованы для проверки терапевтического эффекта глазных капель или смешанных агентов, таких как стволовые клетки, которые потенциально способствуют регенерации эпителия роговицы. Наблюдая за помутнением роговицы, периферической неоваскуляризацией и застойными явлениями конъюнктивы с помощью стереомикроскопа и программного обеспечения для визуализации, можно контролировать терапевтические эффекты на этих животных моделях.
Introduction
Роговица человека состоит из пяти основных слоев и играет ключевую роль в рефракции глаза для поддержания остроты зрения и структурной целостности для защиты внутриглазных тканей1. Самой внешней частью роговицы является эпителий роговицы, состоящий из пяти-шести слоев клеток, которые последовательно дифференцируются от базальных клеток и движутся вверх, чтобы отойти от поверхности глаза1. По сравнению с роговицей у людей и новозеландских кроликов, роговица мыши имеет аналогичную структуру роговицы, но более тонкую периферию, чем центральная часть, из-за уменьшенной толщины эпителия и стромы2. Из-за его уникального положения в глазной оптической системе многие внешние повреждения, такие как механическая травма, бактериальная инокуляция и химические агенты, могут легко поставить под угрозу целостность эпителия и в дальнейшем привести к опасному для зрения дефекту эпителия, инфекционному кератиту, расплавлению роговицы и даже перфорации роговицы.
Хотя различные терапевтические агенты, такие как смазки, антибиотики, противовоспалительные средства, аутосыворотки и амниотическая мембрана, уже использовались для улучшения реэпителизации и уменьшения рубцевания, другие потенциальные методы лечения, которые могут обеспечить заживление ран, уменьшить воспаление и подавить образование рубцов, все еще разрабатываются и тестируются на разных платформах. Были предложены различные животные модели для заживления эпителиальных ран роговицы, включая удаление эпителия роговицы с помощью кольца для удаления ржавчины роговицы у мышей с диабетом 3, линейные царапины над эпителием роговицы мыши стерильной иглой 25 G для бактериальной инокуляции4, удаление эпителия роговицы с помощью трепановс помощью средства для удаления ржавчины роговицы 5, прижигание эпителия над половинойроговицы и лимба6 , истирание роговицы кролика с помощью трепана, вызванное притупленным лезвиемскальпеля 7, и повреждение роговицы крупного рогатого скота путем мгновенного замораживания в жидком азоте8.
Помимо механического повреждения эпителия роговицы, химические агенты также являются распространенными повреждениями поверхности глаза, особенно кислотные и щелочные агенты. Гидроксид натрия (NaOH, 0,1-1 Н в течение 30-60 с) является одним из наиболее часто используемых химических веществ в моделях химического ожога роговицыу мышей и кроликов 9,10,11,12,13. 100% этанол также был нанесен на роговицу в модели химического ожога крысы с последующим дополнительным механическим сломом с использованием хирургического лезвия14. Поскольку поддержание здоровой поверхности глаза зависит от функциональных единиц, включая веки, мейбомиевые железы, слезную систему, конъюнктиву и роговицу, животные модели in vivo имеют некоторые преимущества перед культивируемыми эпителиальными клетками роговицы ex vivo или тканями роговицы. В этой статье демонстрируется мышиная модель ссадины роговицы и модель кролика щелочного ожога роговицы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мышиные и кроличьи модели повреждения роговицы обеспечивают полезную платформу ex vivo и in vivo для мониторинга заживления ран, тестирования новых терапевтических средств и изучения основных механизмов заживления ран и путей лечения. Различные модели животных могут быть использ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование финансировалось Советом по атомной энергии Тайваня (грант No A-IE-01-03-02-02), Министерством науки и технологий (грант No NMRPG3E6202-3) и Chang Gung Medical Research Project (грант No CMRPG3H1281).
Materials
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z. Animal models of corneal injury. Bio Protocol. 5 (13), 1516 (2015).
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
