Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

في المختبر توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63218
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1, 1,4, 1,5, 1, 1
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق التي تتضمن كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لدراسة قلة القلة واستقرارية هيستون ، ومقايسة السحب لأسفل لكشف تفاعلات هيستون تشابيرون هيستون ، والجامعة الأمريكية بالقاهرة لتحليل القياس المتكافئ لمجمعات البروتين ، ومقايسة مرافقة هيستون لتوصيف وظيفيا لمرافقة هيستون مفترضة في المختبر.

Abstract

ترتبط بروتينات الهستون بالحمض النووي (DNA) لتكوين الكروماتين حقيقي النواة. الوحدة الأساسية للكروماتين هي نيوكليوسوم ، يتكون من ثماني هيستون يتكون من نسختين من الهستونات الأساسية H2A و H2B و H3 و H4 ، ملفوفة حول الحمض النووي. يتكون الأوكتامير من نسختين من ثنائي H2A / H2B ونسخة واحدة من رباعي H3 / H4. الهستونات الأساسية عالية الشحنة عرضة لتفاعلات غير محددة مع العديد من البروتينات في السيتوبلازم الخلوي والنواة. تشكل مرافقات هيستون فئة متنوعة من البروتينات التي تنقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة وتساعد على ترسبها على الحمض النووي ، وبالتالي تساعد في عملية تجميع النيوكليوسوم. بعض مرافقي هيستون محددون إما ل H2A / H2B أو H3 / H4 ، وبعضها يعمل كمرافقين لكليهما. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التقنيات المختبرية في المختبر مثل المقايسات المنسدلة ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون جنبا إلى جنب لتأكيد ما إذا كان بروتين معين يعمل كمرافق هيستون.

Introduction

تشكل النيوكليوسومات المكونة من الحمض النووي وبروتينات هيستون الوحدة الهيكلية للكروماتين وتنظم العديد من الأحداث الخلوية الحرجة. يتم تغيير موضع النيوكليوسومات ديناميكيا وإعادة تشكيلها لجعل الحمض النووي في متناول العمليات المختلفة مثل النسخ المتماثل والنسخ والترجمة 1,2. الهستونات الأساسية للغاية إما تميل إلى التفاعل مع البروتينات الحمضية في الوسط الخلوي أو تخضع للتجميع ، مما يؤدي إلى عيوب خلوية مختلفة3،4،5. تساعد مجموعة من البروتينات المخصصة تسمى مرافقو هيستون في نقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة ومنع أحداث تجميع الحمض النووي الهستون الشاذة 6,7. بشكل أساسي ، تقوم معظم مرافقات الهستون بتخزين ونقل الهستونات إلى الحمض النووي بالقوة الأيونية الفسيولوجية ، مما يساعد على تكوين النيوكليوسومات 8,9. بعض مرافقي هيستون لديهم تفضيل واضح لأوليغومرات هيستون H2A / H2B أو H3 / H410.

تتميز مرافقات هيستون بناء على قدرتها على تجميع النيوكليوسومات المعتمدة أو المستقلة عن تخليق الحمض النووي11. على سبيل المثال ، يعتمد عامل تجميع الكروماتين -1 (CAF-1) بينما منظم هيستون A (HIRA) مستقل عن تخليق الحمض النووي12,13. وبالمثل ، تشارك عائلة النيوكليوبلازمين من مرافقي هيستون في تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية وتجميع النيوكليوسوم14. يسهل أفراد عائلة بروتين تجميع النيوكليوسوم (NAP) تكوين هياكل تشبه النيوكليوسوم في المختبر ويشاركون في نقل الهستونات بين السيتوبلازم والنواة15. تعتبر كل من بروتينات عائلة النيوكليوبلازمين وبروتينات عائلة NAP مرافقين هيستون وظيفيين ولكنهما لا يشتركان في أي ميزات هيكلية. بشكل أساسي ، لا توجد ميزة هيكلية واحدة تسمح بتصنيف البروتين على أنه مرافقة هيستون16. يعمل استخدام المقايسات الوظيفية والفيزيائية الحيوية جنبا إلى جنب مع الدراسات الهيكلية بشكل أفضل في توصيف مرافقي الهستون.

يصف هذا العمل الطرق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لتوصيف البروتين على أنه مرافقة هيستون تساعد على تجميع النيوكليوسوم. أولا ، تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتحليل حالة قلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار منسدل لتحديد القوى الدافعة والطبيعة التنافسية لتفاعلات هيستون المرافقة والهيستون. ومع ذلك ، لا يمكن حساب المعلمات الهيدروديناميكية لهذه التفاعلات بدقة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية بسبب شكل البروتين ومعقداته التي تؤثر على هجرتها عبر العمود. لذلك ، تم استخدام الطرد المركزي التحليلي الفائق ، والذي يوفر خصائص جزيئية كبيرة في المحلول تشمل الوزن الجزيئي الدقيق ، والقياس المتكافئ للتفاعل ، وشكل الجزيئات البيولوجية. استخدمت الدراسات السابقة على نطاق واسع مقايسة مرافقة هيستون في المختبر لتوصيف مرافقي هيستون وظيفيا مثل yScS116 17 و DmACF18 و ScRTT106p19 و HsNPM120. كما تم استخدام مقايسة مرافقة هيستون لتوصيف البروتينات وظيفيا على أنها مرافقة هيستون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتوضيح الحالة قليلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون

  1. تحليل الحالة قليلة القسيمات لمرافقي هيستون
    1. موازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (SEC) سعة 24 مل مع حجم عمود 1.2 (CV)، أي 28.8 مل من المخزن المؤقت SEC المنزوع الغازات [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5)، و300 من mM كلوريد الصوديوم، و1 mM من β-mercaptoethanol (β-ME)] عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن تحديد نوع العمود وتكوين المخزن المؤقت ودرجة الحموضة العازلة بناء على البروتين محل الاهتمام. يجب ألا يتجاوز حجم حقن العينة 500 ميكرولتر لعمود 24 مل. أيضا ، يجب الحفاظ على ضغط العمود أقل من 5 ميجا باسكال.
    2. من محلول مخزون بروتين عالي التركيز ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل في محلول SEC منزوع التفريغ وحقنه في العمود المتوازن مسبقا باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    3. راقب ملف شطف البروتين عن طريق قياس الامتصاص بطول موجي يبلغ 280 نانومتر. عند التعامل مع البروتينات التي تفتقر إلى المخلفات العطرية ، قم بقياس الامتصاص عند 214 نانومتر.
    4. استخدم حجم شطف البروتين لحساب وزنه الجزيئي التقريبي بالكيلو دالتون باستخدام منحنى المعايرة القياسي21.
      ملاحظة: يتم تحضير منحنى المعايرة عن طريق رسم حجم الاحتفاظ ببروتينات الوزن الجزيئي المعروفة مقابل سجل الأوزان الجزيئية الخاصة بها (log Mr) ، والتي يتم استخلاصها باستخدام نفس العمود.
  2. تحليل الاستقرار الحراري لمرافقي هيستون
    1. خذ 500 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل من عينة البروتين المحضرة في محلول SEC منزوع التفريغ (نفس المستخدم في 1.1.1) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية وقم بتسخين كل أنبوب إلى درجة حرارة معينة تتراوح بين 20 درجة مئوية و 90 درجة مئوية (20 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 90 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق في حمام مائي.
    2. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات المعالجة حراريا عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجمع المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة ، وحقن كل عينة على حدة باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي ، متوازنة مسبقا مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
  3. تحليل الاستقرار الكيميائي لمرافقي هيستون
    1. لفحص استقرار الملح لمرافقي الهستون ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] مكملة بتركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم (300 مللي متر ، 600 مللي متر ، 1 م ، 1.5 م ، و 2 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية والاحتفاظ بالطارد.
    2. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم بشكل فردي ، باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المعني الذي يحتوي على تركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
    3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي من 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني عند 4 درجات مئوية.
    4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
    5. وبالمثل ، لتحليل استقرار اليوريا ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] تستكمل بتركيزات اليوريا المتزايدة (1 م ، 2 م ، 3 م ، 4 م ، و 5 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واحتفظ بالطارد.
    6. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين المعالجة باليوريا بشكل فردي باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المقابل الذي يحتوي على تركيزات مختلفة من اليوريا في درجة حرارة الغرفة.
    7. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: لا تقم بإجراء التجارب باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على اليوريا عند درجة حرارة منخفضة لأن اليوريا تميل إلى التبلور وإتلاف العمود.
    8. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.

2. مقايسات منسدلة قائمة على تدرج الملح لفهم نوع التفاعلات التي تساهم في التكوين المعقد بين أوليغومرات هيستون ومرافقة هيستون

  1. لكل تفاعل من مقايسة السحب لأسفل ، ماصة 40 ميكرولتر من راتنج Ni-NTA في عمود دوران وتغسل بالماء المقطر المزدوج المعقم. بعد ذلك ، قم بموازنة الراتنج مع 100 CV (4 مل) من محلول التوازن [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 300 mM من NaCl ، 10 mM من imidazole ، 10 μg / mL من BSA ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء السحب لأسفل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. قم بإعداد العينة عن طريق خلط 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون الموسومة بعلامة His-taged مع 20 ميكرومتر من هيستون H2A / H2B dimer أو H3 / H4 tetramer في مخزن التوازن المؤقت. احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحضير ثنائي H2A / H2B ورباعي H3 / H4 من الهستونات البشرية المؤتلفة21 ، ويتم تأكيد سلامة oligomers بناء على الكتل الجزيئية المقدرة بواسطة الطرد المركزي التحليلي الفائق (AUC). تم استخدام نفس أوليغومرات هيستون لجميع التجارب المذكورة أدناه.
  3. قم بتحميل العينات في أعمدة دوران منفصلة متوازنة مسبقا براتنج Ni-NTA من الخطوة 2.1 ، كل منها مسمى لتركيز ملح معين ، واحتفظ بالأعمدة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي الأعمدة في 1000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  4. بعد ذلك ، اغسل الأعمدة ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 mM من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 50 mM من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 mM من β-ME] تحتوي على تركيزات ملح مختلفة (أي 300 mM ، 500 mM ، 600 mM ، 700 mM ، 800 mM ، 900 mM و 1 M NaCl). اغسل كل عمود بمخزن مؤقت يحتوي على تركيز ملح معين.
  5. بعد خطوة غسل الملح ، قم بإخراج البروتين من الأعمدة المختلفة باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الشطف [20 مللي متر من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر من إيميدازول ، و 1 مللي متر من β-ME].
  6. بعد ذلك ، قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE22 وتصور الجل بعد تلطيخه باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250 (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكنك تحميل الراتنج مباشرة على هلام SDS-PAGE بدلا من استخلاص البروتين المرتبط من راتنج Ni-NTA.
    ملاحظة: يمكن تعديل تركيبات الموازنة والغسيل والشطف المؤقت ودرجة الحموضة اعتمادا على البروتين محل الاهتمام.

3. مقايسة منسدلة تنافسية لتحديد تفضيل مرافق هيستون ل H2A / H2B أو H3 / H4

  1. تحضير عمود الدوران كما هو موضح في الخطوة 2.1
  2. احتضان 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون مع 20 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B في 300 ميكرولتر من مخزن التوازن المؤقت (محضر في الخطوة 2.1) لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: يمكن اختيار نسبة أوليغومر هيستون إلى هيستون تشابيرون في التفاعل بناء على بيانات القياس المتكافئ المعروفة ؛ استخدم هيستون الزائد بخمسة أضعاف في حالة عدم توفر معلومات.
  3. قم بالطرد المركزي لمركب histone chaperone-H2A / H2B عند 16200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي راسب. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على عمود الدوران المتوازن مسبقا مع مخزن التوازن المؤقت (المعد في الخطوة 2.1) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل العمود ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 ملي مول من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي متر من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 ملي متر من β-ME] لإزالة ديمر H2A / H2B الزائد. بعد ذلك ، امزج مركب هيستون chaperone-H2A / H2B مع 20-60 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  5. أعد غسل العمود ب 100 CV (4 مل) من مخزن الغسيل المؤقت (معد في الخطوة 3.4) لإزالة أي رباعي H3 / H4 غير منضم وتخفيف العينة باستخدام مخزن الشطف المؤقت (معد في الخطوة 2.5). قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE وتصورها بعد تلطيخها باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250.
    ملاحظة: يمكن عكس الفحص حيث ، أولا ، يمكن خلط رباعي H3 / H4 مع المرافق ، ويسمح للمجمع بالارتباط بخرز Ni-NTA ، ثم يتم تحضين المركب بتركيزات متفاوتة من H2A / H2B dimer.

4. تجارب الطرد المركزي التحليلي - سرعة الترسيب (AUC-SV) لتحليل القياس المتكافئ بين مرافقي الهستون والهستونات

  1. تحضير العينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. قم بتحليل هيستون H2A / H2B dimer المعاد تشكيله ، ورباعي H3 / H4 ، ومرافقة هيستون بشكل منفصل من خلال أنبوب غسيل الكلى المقطوع 7 كيلو دالتون 23 ، مقابل مخزن غسيل الكلى [20 mM من Tris (درجة الحموضة 7.5) ، 300 mM من كلوريد الصوديوم ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد). لتقليل خطأ الخلفية بسبب عدم تطابق المخزن المؤقت ، قم بإجراء غسيل الكلى على نطاق واسع ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، ويفضل ثلاث مرات خلال فترة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون للOD 280 الأولي لعينات البروتين قيمة أعلى بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف لتحقيق OD280 النهائي من 0.3-0.5. يتم ذلك بشكل أساسي لإبطال آثار التخفيف.
    2. قم بتنقية H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer ومرافقة هيستون بشكل فردي باستخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (كما هو مذكور في الخطوة 1). احفظ المخزن المؤقت من المدى لإعداد المزيد من التخفيفات لاحقا واستخدامها كمرجع في خلية AUC.
  2. تحميل عينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. امزج البروتينات المنقاة في حجم نهائي قدره 450 ميكرولتر باستخدام محلول غسيل الكلى من الخطوة 4.1.1 للوصول إلىOD 280 من 0.3-0.6. امزج مرافقة هيستون مع H2A / H2B dimer أو رباعي H3 / H4 لتشكيل معقد في أنابيب تفاعل منفصلة. احتضان مخاليط البروتين لمدة 2-3 ساعات.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على بيانات الترسيب باستخدام نظام المسح الضوئي المتداخل في جهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق. بشكل منفصل ، لخلط البروتينات النقية ، قم بإصلاح تركيز هيستون تشابيرون واحتضانه بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون للحصول على القياس المتكافئ الدقيق.
    2. قم بتجميع الخلية بقطعة مركزية مزدوجة القطاع ونوافذ كوارتز لتجربة AUC-SV باستخدام كاشف امتصاص لجهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق كما هو موضح سابقا بالتفصيل24.
    3. املأ 400 ميكرولتر من محلول العينة و 420 ميكرولتر من محلول غسيل الكلى في القطاعين (العينة والقطاعات المرجعية ، على التوالي) للخلية.
      ملاحظة: يتم استخدام حجم أكبر من المخزن المؤقت في القطاع المرجعي للحفاظ على الغضروف المفصلي المرجعي فوق الغضروف المفصلي للعينة. ومع ذلك ، أثناء استخدام نظام التداخل البصري ، املأ القطاعين بحجم متساو.
    4. قم بوزن الخلايا وموازنتها بدقة وتحميلها في دوار من التيتانيوم بأربعة أماكن (انظر جدول المواد). قم بمحاذاة الخلايا باستخدام العلامات المتوفرة في الجزء السفلي من الخلايا والدوار. قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء واتركه يحدث فراغا حتى ينخفض الضغط إلى أقل من 15 ميكرون من الزئبق وتستقر درجة حرارة الدوار إلى 20 درجة مئوية (عادة ما يستغرق 2-2.5 ساعة).
      ملاحظة: تتضمن معلمات تشغيل AUC درجة الحرارة التجريبية وسرعة الدوار والفاصل الزمني بين عمليات المسح وعدد عمليات المسح التي سيتم جمعها. في حالة تجارب SV ، يتم إعطاء الفاصل الزمني للمسح وفقا للكتلة الجزيئية للبروتين. تتطلب البروتينات الأصغر فترات زمنية أكبر بين عمليات الفحص. يتم ضبط سرعة الدوار أيضا وفقا للكتلة الجزيئية المتوقعة للبروتين ، ويتم إجراء التجربة عند 20 درجة مئوية. تتم مراقبة بيانات الامتصاص عند 280 نانومتر.
    5. للحصول على القياس المتكافئ الدقيق ، حافظ على تركيز هيستون تشابيرون ثابتا واحتضان بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون لتحقيق التشبع.
  3. تحليل بيانات الجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح سابقا25. باختصار ، احسب الكثافة واللزوجة لمكونات المخزن المؤقت باستخدام برنامج SEDNTERP26 (انظر جدول المواد). وبالمثل ، احسب الحجم النوعي الجزئي للبروتين بناء على تركيبة الأحماض الأمينية ، باستخدام SEDNTERP أيضا.
    2. قم بتحميل البيانات من جهاز AUC إلى برنامج SEDFIT27 وحدد الغضروف المفصلي (الخط الأحمر) وأسفل الخلية (الخط الأزرق) وحدود تحليل البيانات (الخطوط الخضراء). اختر توزيع C (s) المستمر كنموذج.
    3. بعد ذلك ، قم بتعيين الدقة القصوى حتى 100 ؛ ضبط معامل الترسيب (S) ، S دقيقة: 0 و S كحد أقصى: 10-15 ؛ اضبط نسبة الاحتكاك على 1.2 في البداية واختر التعويم لاشتقاق النسبة من البيانات ؛ ضبط مستوى الثقة (نسبة F ؛ التي تحدد حجم التنظيم) إلى 0.68 لتنظيم 1 سيغما ؛ قم بتعيين قيم الحجم النوعي الجزئي وكثافة المخزن المؤقت ولزوجة المخزن المؤقت كما تم الحصول عليها من SEDNTERP.
    4. اضغط على RUN للسماح للبرنامج بحل معادلة لام27. اضبط المعلمات إذا كان هناك عدم تطابق كبير في البيانات. بعد ضبط المعلمات ، اضغط على FIT لتحسين جميع المعلمات. قم بتقييم جودة الملاءمة بناء على قيمة انحراف الجذر والمتوسط التربيعي (RMSD) ، والتي يجب أن تكون أقل من 0.01 وحدة إشارة.
    5. قم بتقدير الكتل الجزيئية للقمم عن طريق تحديد الخيار: إظهار الذروة "Mw in c (s)" في وظيفة العرض لشريط الأدوات الرئيسي ، والتي ستوفر معلومات حول "s" للجزيء / المجمع.

5. مقايسة البلازميد فائقة اللف لتأكيد وظيفة مرافقة هيستون

  1. تفاعل تجميع النيوكليوسوم
    1. امزج 2 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 و 4 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B مع تركيزات متزايدة من مرافقة هيستون (1-6 ميكرومتر) في مخزن تجميع [20 مللي متر من Tris HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي متر من DTT ، 1 مللي متر من MgCl2 ، 0.1 مجم / مل من BSA ، و 100 مللي متر من كلوريد الصوديوم] إلى حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. في نفس الوقت ، في تفاعل منفصل ، قم بمعالجة 500 نانوغرام من بلازميد pUC19 ذو اللف الفائق السالب مع 1 ميكروغرام من إنزيم topoisomerase I (انظر جدول المواد) في مخزن التجميع المؤقت في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يعمل Topoisomerase I على إرخاء الحمض النووي البلازميد المزدوج الملتف عن طريق توليد شق مفرد تقطعت به السبل. يمكن استخدام إنزيم توبويزوميراز I من أصل حقيقي النواة ، مثل توبويزوميراز الأول من جنين القمح المتاح تجاريا أو ذبابة الفاكهة المعبر عنها بشكل مؤتلف ذبابة الفاكهة ميلانوجاستر توبويزوميراز I.
    3. بعد ذلك ، ادمج رباعي H3 / H4 ، و H2A / H2B dimer ، وخليط histone chaperone (من الخطوة 5.1.1) ، وخليط تفاعل الحمض النووي البلازميد المريح (من الخطوة 5.1.2) ، واحتضان أكثر عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد تفاعلين للتحكم للفحص ؛ أحدهما يحتوي على مرافقة هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس الهستون) والآخر يحتوي على أوليغومرات هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس مرافقة هيستون).
    4. أوقف تفاعل التجميع بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x (40 مللي متر من EDTA ، و 2٪ من SDS ، و 0.4 مجم / مل من البروتيناز K) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إيقاف المخزن المؤقت يزيل البروتين من الحمض النووي البلازميد عن طريق تمسخ وتحلل البروتين من هستونات مرتبطة.
  2. استخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الإيثانول
    1. أضف حجما متساويا من الفينول المشبع بالتريس في الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل من الخطوة 5.1.4 واخلطه جيدا ، متبوعا بالطرد المركزي عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجمع برفق المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مع ماصة دقيقة واخلطها مع حجم متساو من الكلوروفورم. دوامة الخليط وأجهزة الطرد المركزي في 16200 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تضمين كحول الأيزو أميل في هذه الخطوة لتجنب وجود واجهة غامضة بين المرحلتين المائية والعضوية.
    3. بعد ذلك ، اجمع المرحلة المائية العليا ، وأضف 1/10 حجم 3 م أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.5) و 2.5 حجم من الإيثانول المثلج (انظر جدول المواد). امزج المحلول جيدا عن طريق قلب الأنبوب 3-4 مرات واحتفظ بالمزيج في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لترسيب كامل للحمض النووي البلازميد.
    4. قم بالطرد المركزي للعينة من الخطوة 5.2.3 بسرعة 16200 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية برفق. أبق الأنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتبخر كميات ضئيلة من الإيثانول ، تاركة الحمض النووي البلازميد المترسب في الأنبوب.
  3. أداء الكهربائي هلام agarose لمراقبة تأثير supercoiling البلازميد.
    1. قم بإذابة الحمض النووي البلازميد المترسب من الخطوة 5.2.4 في ماء مقطر مزدوج معقم.
    2. قم بتحليل العينات على هلام أغاروز 1٪ في 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة (40 مللي متر من Tris ، و 20 mM من حمض الخليك ، و 1 mM من EDTA) (انظر جدول المواد).
    3. قم بتلطيخ الجل بتركيز 0.2-0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم وراقبه تحت الأشعة فوق البنفسجية لتصور نطاقات الحمض النووي على الجل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعرض مجال نيوكليوبلازمين N-terminal المؤتلف للبروتين FKBP53 من Arabidopsis thaliana ل SEC التحليلي. تم رسم حجم ذروة الشطف مقابل المنحنى القياسي لتحديد حالته قليلة القسيمة. كشفت نتائج SEC التحليلية أن المجال موجود كمحلول خماسي ، بكتلة جزيئية تقريبية تبلغ 58 كيلو دالتون (الشكل 1 أ ، ب). علاوة على ذلك ، تم تحليل مجال النيوكليوبلازمين من أجل الاستقرار الحراري والكيميائي بالتزامن مع SEC التحليلي. لم تظهر عينة النيوكليوبلازمين الخاضعة للمعالجة الحرارية حتى 90 درجة مئوية أي تحول واضح في حجم الشطف وارتفاع الذروة مقارنة بالعينات المحفوظة عند 20 درجة مئوية ، مما يشير إلى أن المجال شديد الثبات للحرارة (الشكل 1C). وبالمثل ، أظهر مجال النيوكليوبلازمين استقرارا للملح يصل إلى 2 M من كلوريد الصوديوم (الشكل 1D) واستقرار اليوريا حتى 4 M (الشكل 1E). ومع ذلك ، بدأ بنتامر النيوكليوبلازمين في الانفصال بتركيزات أعلى من اليوريا.

تم إجراء اختبار منسدل لتحديد نوع التفاعلات التي تساهم في التكوين المعقد بين مرافقة هيستون (مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53) وأوليغومرات هيستون H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer باستخدام غسل الملح المتدرج. كان تفاعل مجال النيوكليوبلازمين مع ثنائي H2A / H2B مستقرا حتى تركيز ملح يبلغ 0.4 M NaCl (الشكل 2A). وبالمقارنة ، كان الارتباط مع H3 / H4 مستقرا بشكل معقول حتى 0.7 مليون كلوريد الصوديوم (الشكل 2 ب). تشير قدرة مجمعات chaperone-histone على تحمل تركيز الملح العالي إلى دور التفاعلات الكارهة للماء في تثبيت المجمعات. يشير مركب chaperone مع استقرار H3 / H4 حتى في تركيزات الملح العالية إلى دور سائد للتفاعلات الكارهة للماء في التكوين المعقد. يكشف الاستقرار المنخفض لمجمع H2A / H2B-chaperone في تركيزات الملح العالية عن دور مهم للتفاعلات الكهروستاتيكية في التكوين المعقد. في تجربة أخرى ، تم استخدام اختبار السحب لأسفل لفحص ما إذا كان المرافق يفضل إما H2A / H2B dimer أو H3 / H4 tetramer. كشفت النتائج أن المرافق يرتبط ب H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في وقت واحد وبغض النظر عن الترتيب الذي يتم إضافتهما به إلى المرافق (الشكل 2C ، D). هذا يشير إلى أن chaperone يمتلك مواقع منفصلة لتفاعله مع oligomers.

تم إجراء تجارب AUC-SV (الشكل 3) لدراسة القياس المتكافئ للتفاعل بين أوليغومرات الهستون والمرافقين. قدم تحليل بيانات AUC-SV قيمة معامل (معامل) ترسيب تبلغ 5.40 S لمجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مجمع مع H2A / H2B يتوافق مع كتلة جزيئية تبلغ 104 كيلو دالتون. أعطى مجمع مجال النواة مع H3 / H4 قيمة معامل الترسيب 7.35 S ، أي ما يعادل 129 كيلو دالتون. تكشف الكتلة الجزيئية المقدرة للمجمعات أن بلازمين النيوكليوبلازمين الخماسي يتشكل معقدا مع كل من H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer في قياس متكافئ 1: 1.

من الضروري إظهار أن البروتين يمكن أن يودع أوليغومرات هيستون في الحمض النووي للتأكد من أنه مرافقة هيستون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم اعتماد اختبار البلازميد الفائق (الشكل 4). تم تحضين البلازميد الدائري المريح مع أوليغومرات هيستون H2A / H2B و H3 / H4 مع مرافقي هيستون النبات المؤتلف من عائلة NAP - AtNRP1 و AtNRP228. أدى وجود المرافقون إلى زيادة كمية البلازميد فائق الالتفاف ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يودع الهستونات على الحمض النووي لتكوين النيوكليوسومات ، مما يتسبب في الالتفاف الفائق للحمض النووي.

Figure 1
الشكل 1: حالة قلة القسيمات واستقرار مجال بلازما النيوكليوبلازمين في AtFBP53. (أ) ملف كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53. (ب) منحنى المعايرة الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتينات الكروية ذات الكتلة الجزيئية المعروفة. تمثل النقاط الزرقاء الكتلة الجزيئية للبروتينات المعروفة ، بينما تمثل النقطة الحمراء مجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53. (440 كيلو دالتون - فيريتين ، 158 كيلو دالتون ألدولاز ، 75 كيلو دالتون كون ألبومين ، 44 كيلو دالتون أوفالبومين ، 6.5 كيلو دالتون أبروتينين). (C) كروماتوجرام تحليلي لاستبعاد الحجم يبلغ 500 ميكرولتر من مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 الخاضع للمعالجة الحرارية عند درجات حرارة مختلفة: 20 درجة مئوية (خضراء) ، 40 درجة مئوية (برتقالي) ، 60 درجة مئوية (أسود) ، 90 درجة مئوية (أزرق فاتح). (د) كروماتوجرام تحليلي لاستبعاد الحجم يبلغ 500 ميكرولتر من مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مخازن مؤقتة تحتوي على تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم: 0.3 م (أرجواني) ، 0.6 م (أحمر) ، 1.0 م (أزرق فاتح) ، 1.5 م (أخضر) ، 2.0 م (أسود). (ه) كروماتوجرام استبعاد الحجم التحليلي لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53 في مخازن مؤقتة بتركيزات مختلفة من اليوريا: 0 M (تحكم ؛ أزرق فاتح) ، 1.0 M (وردي) ، 2.0 M (أسود) ، 3.0 M (أزرق غامق) ، 4.0 M (أخضر) ، 5.0 M (بني). يظهر بنتامر النيوكليوبلازمين ثباتا عاليا لظروف الإجهاد الحراري والكيميائي. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: المقايسات المنسدلة لتفاعل مجال النيوكليوبلازمين ل AtFKBP53 مع أوليغومرات الهيستون. يتم عرض 18٪ من صور SDS-PAGE لكسور الشطف من المقايسات هنا. مقايسة السحب لأسفل ل ( A ) 20 μM H2A / H2B dimer و (B) 20 μM H3 / H4 tetramer مع 5 μM AtFKBP53 مجال نيوكليوبلازمين في تركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم في نطاق 0.3 M و 0.5 M و 0.6 M و 0.7 M و 0.8 M و 0.9 M و 1.0 M. 5 ميكرومتر AtFKBP53 FKBD تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي هنا. بالنسبة لتجربة الربط التنافسي ، ( C ) تم استخدام خليط من مجال نيوكليوبلازمين 5 μM AtFKBP53 و 20 μM H3 / H4 tetramer محتضن بمدى 20-60 μM H2A / H2B dimer و (D) خليط من 5 μM AtFKBP53 مجال نيوكليوبلازمين و 20 ميكرومتر H2A / H2B dimer محتضنة مع مجموعة من 20-60 μM H3 / H4 tetramer. تتوافق التسمية AtFKBP53 مع مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53. تظهر كسور الشطف ارتباطا متزامنا لكل من أوليغومرات هيستون بالنيوكليوبلازمين. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تجربة الطرد المركزي التحليلي - سرعة الترسيب (AUC-SV) لأوليغومرات هيستون ، ومجال بلازما النيوكليوبلازمين ل AtFKBP53 ، ومعقداتها. توزيع المسافة بين الجامعة الأمريكية بالقاهرة مقابل معامل الترسيب (S) المؤامرة. يتم أيضا توفير قيم معامل (معامل) الترسيب التي تم الحصول عليها والكتل الجزيئية. تتوافق التسمية AtFKBP53 مع مجال نيوكليوبلازمين AtFKBP53. تكشف الكتل الجزيئية المقدرة عن قياس متكافئ 1: 1 لمجال بلازما النيوكليوبلازمين AtFKBP53 مع أوليغومرات هيستون H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer. تم استخدام 450 ميكرولتر من جميع عينات البروتين التي تحتوي على OD280 من 0.3-0.5 لتجارب AUC-SV. الشكل مقتبس من المرجع21. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مقايسة البلازميد الفائق اللفائف. مقايسة البلازميد الفائقة لمرافقي هيستون AtNRP1 و AtNRP2. تمت معالجة 500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد pUC19 ب 1 ميكروغرام من Topoisomerase I للتجربة. 4 ميكرومتر AtNRP1 ، 4 ميكرومتر AtNRP2 ، وخليط من 4 ميكرومتر H2A / H2B dimer و 2 μM H3 / H4 رباعي كانت كعنصر تحكم لا يظهر أي نشاط فائق الالتفاف عند حضنها بالحمض النووي pUC19 المعالج مسبقا. تظهر الممرات التي تحتوي على خليط من 4 μM H2A / H2B من dimer و 2 μM H3 / H4 من tetramer و 4 μM لكل من AtNRP1 و AtNRP2 تكوين الحمض النووي فائق الالتفاف عند الحضانة مع الحمض النووي pUC19 المعالج مسبقا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوضح هذا العمل ويتحقق من صحة مجموعة شاملة من البروتوكولات للتوصيف البيوكيميائي والبيوفيزيائي لمرافق هيستون المفترض. هنا ، تم استخدام بروتينات عائلة NAP المعبر عنها والمنقاة ، AtNRP1 و AtNRP2 ، ومجال بلازما النواة N-terminal ل AtFKBP53 لإظهار البروتوكولات. يمكن استخدام نفس المجموعة من التجارب لتحديد السمات الوظيفية لمرافقي هيستون غير المميزين سابقا من أي كائن حي.

يتضمن الجزء الأول من قسم البروتوكول التحقيق في حالة قلة القلة، واستقرار مرافق هيستون. تشير العديد من التقارير إلى أن مرافقي هيستون يظهرون تنوعا كبيرا في حالتهم قليلة القلة. على سبيل المثال ، يوجد CAF-1 البشري كمونومر29. يوجد أفراد عائلة NAP مثل dimer أو tetramer29،30،31. تكشف النيوكليوبلازمينات عن حالات قلة القسيمات الخماسية وغالبا ما تكون ديكاميري32,33. يمكن لتجربة SEC التحليلية تحديد الحالة قليلة القسيمات لمرافقة هيستون ، ويمكن لتجارب AUC-SV تأكيد ذلك. من المعروف أن العديد من مرافقي هيستون مستقرون للغاية في ظل ظروف الإجهاد الحراري والكيميائي المختلفة33,34. يمكن أيضا استكشاف ميزات الاستقرار الحراري والكيميائي لمرافقي هيستون بالاقتران مع SEC التحليلي. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام التحليل الطيفي الدائري ثنائي اللون بشكل فعال للتحليل المتعمق للتغيرات في البنية الثانوية للمرافق عند تعرضها لدرجات حرارة متزايدة أو تركيزات أعلى من عامل كيميائي.

يغطي الجزء الثاني من قسم البروتوكول المقايسات المنسدلة التي يمكن أن تدرس التفاعلات الأساسية التي تساعد في ارتباط أوليغومرات هيستون مع المرافق باستخدام نهج تدرج الملح ومقايسة منسدلة تنافسية لتحديد تفضيل أوليغومر هيستون للمرافق. إذا انهار المركب مع زيادة طفيفة في تركيز الملح ، فإن ذلك يشير إلى مساهمة كبيرة للتفاعلات الكهروستاتيكية في تثبيت المجمع. قد يشير المركب السليم في الملح العالي إلى دور مهم لكاره الماء في تثبيت المركب35. يمكن استخدام الفحص التنافسي المنسدل بسهولة لتحديد خصوصية أو تفضيل مرافق هيستون لفئة معينة من أوليغومر هيستون. بناء على تفضيلهم تجاه oligomers، يمكن تصنيف مرافقي هيستون إلى ثلاث فئات مثل مرافقي H2A / H2B ، ومرافقي H3 / H4 ، ومرافقي H2A / H2B-H3 / H410,36. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لفهم خصوصية oligomer هيستون لمرافق معين والخصائص الديناميكية الحرارية لتفاعلاتهم.

يغطي الجزء الثالث من قسم البروتوكول التحقيق في القياس الكيميائي للتفاعل بين مرافقي هيستون وأوليغومرات هيستون. بشكل عام ، تختلف العائلات المختلفة لمرافقي الهستون اختلافا كبيرا في القياس المتكافئ لارتباطهم ب H2A / H2B أو / و H3 / H421،28،37،38. تساعد تجربة AUC-SV في الحصول على معامل (معامل) الترسيب والكتلة الجزيئية للبروتين أو معقده ، والذي يصبح مفيدا جدا في تقدير القياس الكيميائي بدقة في التكوين المعقد. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام ITC لفحص القياس المتكافئ.

يركز الجزء الرابع من قسم البروتوكول على التحقيق في وظيفة تجميع النيوكليوسوم لمرافقي الهستون. يلعب مرافقو هيستون دورا مهما في تجميع النيوكليوسوم ، الذي ينظم العمليات الخلوية الحيوية مثل النسخ المتماثل والنسخ وإصلاح الحمض النووي39. يتم تفصيل مقايسة البلازميد الفائقة التي تستخدم عادة للتقييم في المختبر لنشاط مرافقة هيستون لمرافقي الهستون في هذا القسم.

تجدر الإشارة إلى أنه ليس كل مرافقي هيستون منظمون بالكامل. من المعروف أن القليل منهم لديهم مناطق مضطربة جوهريا40,41. لذلك ، قد لا تكون فحوصات الاستقرار الحراري والكيميائي مناسبة لمثل هذه البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن مرافقي هيستون من كائنات مختلفة لديهم حالات قليلة القسيمات مختلفة وقدرات تفاضلية للارتباط بالهستونات. لذلك ، قد يكون هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة ولكنه قد يستلزم تعديلات حسب الضرورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

المنح الخارجية لديليب فاسوديفان من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند [CRG / 2018 / 000695 / PS] وإدارة التكنولوجيا الحيوية ، وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ، بالإضافة إلى الدعم الداخلي من معهد علوم الحياة ، بوبانسوار معترف بها إلى حد كبير. نشكر السيدة سوديشنا سين والسيدة أنابورنا ساهو على مساعدتهما في إعداد الهيستون. كما نعرب عن تقديرنا للمناقشات مع زملائنا الدكتور تشينمايي موهاباترا والسيد ماناس كومار جاغديف والدكتور شيخ نوساد حسين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 178 ، هيستون تشابيرون ، تجميع النيوكليوسوم ، الكروماتين ، النيوكليوبلازمين ، NAP ، البلازميد الفائق اللف ، الطرد المركزي التحليلي
<em>في المختبر</em> توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral,… More

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter