Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Karakterisering av Histone Chaperones ved hjelp av analytiske, nedtrekkbare og chaperoning analyser

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63218
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1, 1,4, 1,5, 1, 1
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver et batteri av metoder som inkluderer analytisk størrelseseksklusjonskromatografi for å studere histon chaperone oligomerisering og stabilitet, nedtrekksanalyse for å avdekke histon chaperone-histon interaksjoner, AUC for å analysere støkiometrien til proteinkompleksene, og histon chaperoning analyse for å funksjonelt karakterisere en antatt histon chaperone in vitro.

Abstract

Histonproteiner knytter seg til DNA for å danne eukaryotisk kromatin. Den grunnleggende enheten av kromatin er et nukleosom, som består av en histonoktamer som består av to kopier av kjernehistonene H2A, H2B, H3 og H4, pakket rundt av DNA. Oktameren består av to kopier av en H2A/H2B dimer og en enkelt kopi av en H3/H4 tetramer. De høyt ladede kjernehistonene er utsatt for ikke-spesifikke interaksjoner med flere proteiner i cellulær cytoplasma og kjernen. Histon chaperones danner en mangfoldig klasse proteiner som skyttelbuss histoner fra cytoplasma inn i kjernen og hjelper deres avsetning på DNA, og dermed hjelper nukleosommonteringsprosessen. Noen histon chaperones er spesifikke for enten H2A / H2B eller H3 / H4, og noen fungerer som chaperones for begge. Denne protokollen beskriver hvordan in vitro laboratorieteknikker som nedtrekksanalyser, analytisk størrelseseksklusjonskromatografi, analytisk ultra-sentrifugering og histon chaperoning assay kan brukes i tandem for å bekrefte om et gitt protein er funksjonelt som en histon chaperone.

Introduction

Nukleosomer sammensatt av DNA- og histonproteiner danner den strukturelle enheten av kromatin og regulerer flere kritiske cellulære hendelser. Nukleosomer blir dynamisk omplassert og ombygd for å gjøre DNA tilgjengelig for ulike prosesser som replikasjon, transkripsjon og oversettelse 1,2. Histoner som er svært basiske, har enten en tendens til å interagere med sure proteiner i det cellulære miljøet eller gjennomgå aggregering, noe som fører til forskjellige cellulære defekter 3,4,5. En gruppe dedikerte proteiner kalt histon chaperones hjelper transporten av histoner fra cytoplasma til kjernen og forhindrer avvikende histon-DNA-aggregeringshendelser 6,7. I utgangspunktet lagrer og overfører de fleste histon-chaperoner til DNA ved fysiologisk ionstyrke, og hjelper dermed dannelsen av nukleosomer 8,9. Noen histon chaperones har en klar preferanse for histon oligomerer H2A / H2B eller H3 / H410.

Histon chaperones er karakterisert basert på deres evne til å montere nukleosomer avhengig eller uavhengig av DNA-syntese11. For eksempel er kromatinmonteringsfaktor-1 (CAF-1) avhengig mens histonregulator A (HIRA) er uavhengig av DNA-syntese12,13. På samme måte er nukleoplasminfamilien av histon-chaperoner involvert i sædkromatindekondensering og nukleosommontering14. Nukleosommonteringsproteinet (NAP) familiemedlemmer letter dannelsen av nukleosomlignende strukturer in vitro og er involvert i shuttling av histoner mellom cytoplasma og kjerne15. Nukleoplasminer og NAP-familieproteiner er begge funksjonelle histon-chaperoner, men deler ingen strukturelle egenskaper. I hovedsak tillater ingen enkelt strukturell funksjon klassifiseringen av et protein som en histon chaperone16. Bruken av funksjonelle og biofysiske analyser sammen med strukturelle studier fungerer best i å karakterisere histon chaperones.

Dette arbeidet beskriver biokjemiske og biofysiske metoder for å karakterisere et protein som en histon chaperone som hjelper nukleosommontering. Først ble analytisk størrelseseksklusjonskromatografi utført for å analysere oligomer status og stabilitet av histon chaperones. Deretter ble det utført en nedtrekksanalyse for å bestemme drivkreftene og konkurranseinstinktet til histon chaperone-histon-interaksjoner. De hydrodynamiske parametrene for disse interaksjonene kunne imidlertid ikke beregnes nøyaktig ved hjelp av analytisk størrelseseksklusjonskromatografi på grunn av proteinets form og dets komplekser som påvirker deres migrasjon gjennom kolonnen. Derfor ble analytisk ultracentrifugering brukt, som gir makromolekylære egenskaper i løsningen som inkluderer nøyaktig molekylvekt, støkiometri av interaksjon og formen på de biologiske molekylene. Tidligere studier har i stor grad brukt in vitro histon chaperoning analyse for å funksjonelt karakterisere histon chaperones som yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Histon chaperoning analyse ble også brukt til å funksjonelt karakterisere proteiner som histon chaperones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Analytisk størrelseseksklusjonskromatografi for å belyse oligomer status og stabilitet av histon-chaperoner

  1. Analyse av den oligomere statusen til histon-chaperoner
    1. Likevekt en 24 ml analytisk størrelseseksklusjonskromatografikolonne (SEC) med 1,2 kolonnevolum (CV), dvs. 28,8 ml avgasset SEC-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl og 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ved 4 °C (se tabell over materialer).
      MERK: Kolonnetype, buffersammensetning og buffer-pH kan velges basert på proteinet av interesse. Prøveinjeksjonsvolumet bør ikke overstige 500 μL for en 24 ml kolonne. Kolonnetrykket må også opprettholdes under 5 MPa.
    2. Fra en proteinstamløsning med høyere konsentrasjon, lag 500 μL 0,5 mg / ml proteinprøve i avgasset SEC-buffer og injiser den i den forhåndsbalanserte kolonnen ved hjelp av en 500 μL injeksjonssløyfe. La kromatografikjøringen fortsette med en isokratisk strømningshastighet på 0,2-0,3 ml/min med SEC-bufferen ved 4 °C.
    3. Overvåk elueringsprofilen til proteinet ved å måle absorbans ved en bølgelengde på 280 nm. Når du arbeider med proteiner som mangler aromatiske rester, måler du absorbansen ved 214 nm.
    4. Bruk elueringsvolumet til proteinet til å beregne den omtrentlige molekylvekten i kDa ved hjelp av standard kalibreringskurve21.
      MERK: Kalibreringskurven fremstilles ved å plotte retensjonsvolumet av kjente molekylvektproteiner mot loggen av deres respektive molekylvekter (log Mr), eluert ved hjelp av samme kolonne.
  2. Analyse av den termiske stabiliteten til histon-chaperonene
    1. Ta 500 μL 0,5 mg / ml av proteinprøven fremstilt i avgasset SEC-buffer (samme som brukt i 1.1.1) i individuelle mikrosentrifugerør og varm hvert rør til en bestemt temperatur mellom 20 ° C og 90 ° C (20 ° C, 40 ° C, 60 ° C og 90 ° C) i 10 minutter i et vannbad.
    2. Deretter sentrifugerer du de varmebehandlede prøvene ved 16 200 x g i 10 minutter ved 4 °C, samler supernatanten med en mikropipette og injiserer hver prøve individuelt ved hjelp av en 500 μL injeksjonssløyfe i analysekolonnen, forhåndslikevektet med SEC-bufferen ved 4 °C.
    3. La kromatografikjøringen fortsette med en isokratisk strømningshastighet på 0,2-0,3 ml/min med SEC-bufferen ved 4 °C.
    4. Vær oppmerksom på posisjonen og høyden på elueringstoppene og se etter utseendet til flere topper for de forskjellige prøvene.
  3. Analyse av den kjemiske stabiliteten til histon-chaperonene
    1. For å undersøke saltstabiliteten til histon-chaperoner, inkuber 500 μL 0,5 mg / ml proteinprøve fremstilt i en Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM β-ME] supplert med økende konsentrasjoner av NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M og 2 M) i separate mikrosentrifugerør i 30 minutter ved 4 ° C. Sentrifuger prøvene ved 16 200 x g i 10 minutter ved 4 °C og beholder supernatanten.
    2. Deretter laster du proteinprøvene i forskjellige NaCl-konsentrasjoner individuelt, ved hjelp av en 500 μL injeksjonssløyfe i den analytiske kolonnen som er forhåndsutjevnet med 1,2 CV (28,8 ml) av den respektive bufferen som inneholder økende NaCl-konsentrasjoner ved 4 °C.
    3. La kromatografikjøringen fortsette med en isokratisk strømningshastighet på 0,2-0,3 ml/min med 1 CV (24 ml) av den respektive bufferen ved 4 °C.
    4. Vær oppmerksom på posisjonen og høyden på elueringstopper og se etter utseendet til flere topper for de forskjellige prøvene.
    5. På samme måte, for ureastabilitetsanalyse, inkuber du 500 μL 0,5 mg / ml proteinprøve fremstilt i en Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM β-ME] supplert med økende ureakonsentrasjoner (1 M, 2 M, 3 M, 4 M og 5 M) i separate mikrosentrifugerør i 16 timer ved romtemperatur. Sentrifuger prøvene ved 16 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur og beholder supernatanten.
    6. Deretter legger du de ureabehandlede proteinprøvene individuelt ved hjelp av en 500 μL injeksjonssløyfe i den analytiske kolonnen som er forhåndsutjevnet med 1,2 CV (28,8 ml) av den tilsvarende bufferen som inneholder forskjellige ureakonsentrasjoner ved romtemperatur.
    7. La kromatografikjøringen fortsette med en isokratisk strømningshastighet på 0,2-0,3 ml/min med 1 CV (24 ml) av den respektive bufferen ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: Ikke utfør forsøkene med buffer som inneholder urea ved lavere temperatur, da urea har en tendens til å krystallisere og skade kolonnen.
    8. Vær oppmerksom på posisjonen og høyden på elueringstoppene og se etter utseendet til flere topper for de forskjellige prøvene.

2. Saltgradientbaserte nedtrekksanalyser for å forstå typen interaksjoner som bidrar til den komplekse dannelsen mellom histonoligomerer og en histon-chaperon

  1. For hver reaksjon av nedtrekksanalyse, pipette 40 μL Ni-NTA harpiks i en spinnkolonne og vask med sterilt dobbeltdestillert vann. Deretter balanserer du harpiksen med 100 CV (4 ml) likevektsbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10 μg/ml BSA og 1 mM β-ME] (se Materialtabell).
    MERK: Nedtrekk kan også utføres i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Forbered prøven ved å blande 5 μM av His-merket histon chaperone med enten 20 μM histon H2A / H2B dimer eller H3 / H4 tetramer i likevektsbufferen. Inkuber prøven på is i 1 time.
    MERK: H2A / H2B dimer og H3 / H4 tetramer fremstilles fra rekombinante humane histoner21, og oligomerenes integritet bekreftes basert på de estimerte molekylmassene ved analytisk ultracentrifugering (AUC). De samme histonoligomerene har blitt brukt til alle eksperimenter nevnt nedenfor.
  3. Legg prøvene i separate forhåndsbalanserte spinnkolonner med Ni-NTA-harpiks fra trinn 2.1, hver merket for en bestemt saltkonsentrasjon, og hold kolonnene i 30 minutter ved 4 ° C. Sentrifuge kolonnene ved 1000 x g i 1 min.
  4. Vask deretter kolonnene med 100 CV (4 ml) vaskebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM imidazol, 0,2% Tween-20 og 1 mM β-ME] som inneholder forskjellige saltkonsentrasjoner (dvs. 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM og 1 M NaCl). Vask hver kolonne med en buffer som har en bestemt saltkonsentrasjon.
  5. Etter saltvasketrinnet eluerer du proteinet fra de forskjellige kolonnene ved å bruke 100 μL elueringsbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol og 1 mM β-ME].
  6. Deretter utsetter du de eluerte prøvene for 18 % SDS-SIDE22 og visualiserer gelen etter farging med Coomassie Brilliant Blue R250 (se Materialtabell). Alternativt kan du legge harpiksen direkte på SDS-PAGE-gelen i stedet for å eluere det bundne proteinet fra Ni-NTA-harpiksen.
    MERK: Sammensetninger av likevekts-, vaske- og elueringsbuffer og pH kan endres avhengig av proteinet av interesse.

3. Konkurransedyktig nedtrekksanalyse for å identifisere preferansen til en histon-chaperone for H2A / H2B eller H3 / H4

  1. Klargjøre spinnkolonnen som beskrevet i trinn 2.1
  2. Inkuber 5 μM av histon chaperone med 20 μM H2A / H2B dimer i 300 μL likevektsbuffer (fremstilt i trinn 2.1) i 30 minutter på is.
    MERK: Forholdet mellom histon oligomer og histon chaperone i reaksjonen kan velges basert på kjente bindende støkiometridata; Bruk fem ganger overflødig histon hvis ingen informasjon er tilgjengelig.
  3. Sentrifuge histon chaperone-H2A/H2B-komplekset ved 16 200 x g i 5 minutter ved 4 °C for å fjerne bunnfall. Deretter laster du prøven på spinnkolonnen som er forhåndsutjevnet med likevektsbuffer (klargjort i trinn 2.1) og inkuberer i 30 minutter ved 4 °C.
  4. Vask kolonnen med 100 CV (4 ml) vaskebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, 0,2 % mellom Tween-20 og 1 mM β-ME] for å fjerne overflødig H2A/H2B dimer. Bland deretter histon chaperone-H2A / H2B-komplekset med 20-60 μM H3 / H4 tetramer og inkuber i 30 minutter på is.
  5. Vask kolonnen på nytt med 100 CV (4 ml) vaskebuffer (klargjort i trinn 3.4) for å fjerne ubundet H3/H4-tetramer og eluere prøven ved hjelp av elueringsbuffer (klargjort i trinn 2.5). Utsett de eluerte prøvene for 18 % SDS-PAGE og visualiser etter farging med Coomassie Brilliant Blue R250.
    MERK: Analysen kan reverseres der først H3/H4-tetramer kan blandes med chaperone, komplekset får lov til å binde seg til Ni-NTA-perler, og komplekset inkuberes deretter med varierende konsentrasjoner av H2A/H2B-dimer.

4. Analytisk ultracentrifugation - sedimentasjonshastighet (AUC-SV) eksperimenter for å analysere bindingsstøkiometri mellom histon-chaperoner og histoner

  1. Prøvepreparering for AUC
    1. Dialyser den rekonstituerte histon H2A/H2B dimeren, H3/H4-tetrameren og histon-chaperonen separat gjennom en 7 kDa cut-off dialyseslange23, mot en dialysebuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl og 1 mM β-ME] (se Materialtabell). For å minimere bakgrunnsfeil på grunn av bufferkonflikt, utfør dialyse mye mot dialysebufferen, helst tre ganger over en periode på 24 timer.
      MERK: Den første OD 280 av proteinprøvene skal ha en to til en tre ganger høyere verdi for å oppnå en endelig OD280 på 0,3-0,5. Dette gjøres i hovedsak for å oppheve effekten av fortynning.
    2. Rens H2A / H2B dimer, H3 / H4 tetramer og histon chaperone individuelt med dialysebufferen, ved hjelp av analytisk størrelse-eksklusjonskromatografi (som nevnt i trinn 1). Lagre bufferen fra kjøringen for å klargjøre ytterligere fortynninger senere og for bruk som referanse i AUC-cellen.
  2. Prøvelasting for AUC
    1. Bland de rensede proteinene i et endelig volum på 450 μL ved hjelp av dialysebuffer fra trinn 4.1.1 for å nå en OD280 på 0,3-0,6. Bland histon chaperone med H2A / H2B dimer eller H3 / H4 tetramer for kompleks dannelse i separate reaksjonsrør. Inkuber proteinblandingene i 2-3 timer.
      MERK: Alternativt kan sedimenteringsdata innhentes med et interferens optisk skanningssystem i den analytiske ultrasentrifugen. Separat, for blanding av rensede proteiner, fikser histon chaperonkonsentrasjonen og inkuberer den med økende konsentrasjoner av histonoligomerene for å oppnå nøyaktig støkiometri.
    2. Sett sammen cellen med et dobbelt sektorsenter og kvartsvinduer for AUC-SV-eksperimentet ved hjelp av en absorbansdetektor av den analytiske ultracentrifugen som beskrevet tidligere i detalj24.
    3. Fyll 400 μL av prøveløsningen og 420 μL dialysebuffer i de to sektorene (henholdsvis utvalgs- og referansesektorer) i cellen.
      MERK: Et større volum buffer brukes i referansesektoren for å holde referansemenisken over menisken i prøven. Men mens du bruker et optisk interferenssystem, fyll de to sektorene med like volum.
    4. Vei og balanser cellene nøyaktig og last dem inn i en fire-plassers titanrotor (se Materialtabell). Juster cellene ved hjelp av merkene nederst på cellene og rotoren. Legg rotoren i sentrifugen, lukk lokket og la det utvikle et vakuum til trykket faller til mindre enn 15 mikron Hg og rotortemperaturen stabiliserer seg til 20 ° C (tar vanligvis 2-2,5 timer).
      MERK: AUC-driftsparametere inkluderer eksperimentell temperatur, rotorhastighet, intervallet mellom skanninger og antall skanninger som skal samles inn. Når det gjelder SV-eksperimenter, er skanneintervallet gitt i henhold til proteinets molekylmasse; Mindre proteiner krever større tidsintervaller mellom skanningene. Rotorhastigheten settes også i henhold til proteinets forventede molekylmasse, og forsøket utføres ved 20 °C. Absorbansdataene overvåkes ved 280 nm.
    5. For å oppnå nøyaktig støkiometri, hold histonkonsentrasjonen konstant og inkuber med økende konsentrasjoner av histonoligomerer for å oppnå metning.
  3. Analyse av AUC-data
    1. Utfør dataanalysen som tidligere beskrevet25. Beregn kort tetthet og viskositet for bufferkomponentene ved hjelp av programmet SEDNTERP26 (se materialtabell). På samme måte beregner du det partielle spesifikke volumet av proteinet basert på aminosyresammensetningen, også ved bruk av SEDNTERP.
    2. Last dataene fra AUC-maskinen inn i programmet SEDFIT27 og definer menisken (rød linje), cellebunnen (blå linje) og dataanalysegrensene (grønne linjer). Velg kontinuerlig C(er)-fordeling som modell.
    3. Deretter setter du oppløsningsmaksimum opp til 100; sett sedimenteringskoeffisient (s), s min: 0 og s maks: 10-15; sett friksjonsforhold til 1,2 i utgangspunktet og velg å flyte for å utlede forholdet fra dataene; sett konfidensnivå (F-forhold; som bestemmer størrelsen på regularisering) til 0,68 for 1 sigma regularisering; angi delvis spesifikke volum-, buffertetthets- og bufferviskositetsverdier som hentet fra SEDNTERP.
    4. Trykk på RUN for å la programvaren løse Lamm-ligningen27. Juster parameterne hvis det er en betydelig datakonflikt. Etter å ha justert parametrene, trykk FIT for å avgrense alle parametere. Vurder kvaliteten på passformen basert på RMSD-verdien (root-mean-square deviation), som skal være mindre enn 0,01 signalenheter.
    5. Beregn molekylmassene til toppene ved å velge alternativet: vis topp "Mw i c (s)" i displayfunksjonen til hovedverktøylinjen, som vil gi informasjon om 's' av molekylet / komplekset.

5. Plasmid supercoiling assay for å bekrefte histon chaperoning funksjon

  1. Nukleosommonteringsreaksjon
    1. Bland 2 μM H3/H4-tetramer og 4 μM H2A/H2B-dimer med økende konsentrasjoner av histon-chaperonet (1-6 μM) i en monteringsbuffer [20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA og 100 mM NaCl] til et sluttvolum på 50 μL. Inkuber blandingen ved 4 °C i 30 minutter.
    2. Samtidig, i en separat reaksjon, forbehandle 500 ng av det negativt supercoiled pUC19 plasmidet med 1 μg topoisomerase I enzym (se materialtabell) i monteringsbufferen i et sluttvolum på 50 μL og inkubere ved 30 ° C i 30 minutter.
      MERK: Topoisomerase Jeg slapper av det supercoiled dobbeltstrengede plasmid-DNA ved å generere et enkeltstrenget nick. Et topoisomerase I-enzym av eukaryot opprinnelse, som den kommersielt tilgjengelige hvetekimen topoisomerase I eller rekombinant uttrykt Drosophila melanogaster topoisomerase I, kan brukes.
    3. Deretter kombinerer du H3/H4-tetrameren, H2A/H2B-dimeren, histon-chaperonblandingen (fra trinn 5.1.1), den avslappede plasmid-DNA-reaksjonsblandingen (fra trinn 5.1.2) og inkuberer videre ved 30 °C i 90 minutter.
      MERK: Sett opp to kontrollreaksjoner for analysen; den ene har histon chaperone og avslappet plasmid DNA (men ikke histoner) og den andre har histon oligomerer og avslappet plasmid DNA (men ikke histon chaperone).
    4. Stopp monteringsreaksjonen ved å tilsette 100 μL 2x stoppbuffer (40 mM EDTA, 2% SDS og 0,4 mg / ml proteinase K) og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
      MERK: Stoppbuffer deproteiniserer plasmid-DNA ved denaturering og proteolyse av bundne histoner.
  2. Fenol-kloroformekstraksjon og etanolutfelling
    1. Tilsett et likt volum Tris-mettet fenol i røret som inneholder reaksjonsblandingen fra trinn 5.1.4 og bland godt, etterfulgt av sentrifugering ved 16 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    2. Samle forsiktig den øvre vandige fasen som har plasmid-DNA med en mikropipette og bland med et like volum kloroform. Vortex blandingen og sentrifugen ved 16 200 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Isoamylalkohol kan inkluderes på dette trinnet for å unngå et fuzzy grensesnitt mellom vandige og organiske faser.
    3. Deretter samler du den øvre vandige fasen, tilsett 1/10 volum av 3 M natriumacetat (pH 5,5) og 2,5 volumer iskald etanol (se materialtabell). Bland løsningen godt ved å snu røret 3-4 ganger og oppbevar blandingen i en -20 °C fryser i 30 minutter for fullstendig utfelling av plasmid-DNA.
    4. Sentrifuger prøven fra trinn 5.2.3 ved 16200 x g i 10 minutter og kast supernatanten forsiktig. Hold rørene åpne ved romtemperatur til selv spormengder av etanol fordamper, og la det utfelte plasmid-DNA være i røret.
  3. Utfør agarosegelelektroforese for å observere plasmid supercoiling-effekten.
    1. Oppløs det utfelte plasmid-DNA fra trinn 5.2.4 i sterilt dobbeltdestillert vann.
    2. Løs prøvene på en 1% agarosegel i 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA) (se materialtabell).
    3. Fest gelen med 0,2-0,5 μg / ml konsentrasjon av ethidiumbromid og observer under UV for å visualisere DNA-båndene på gelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det rekombinante N-terminale nukleoplasmindomenet til proteinet FKBP53 fra Arabidopsis thaliana ble utsatt for analytisk SEC. Elueringstoppvolumet ble plottet mot standardkurven for å identifisere dens oligomere tilstand. De analytiske SEC-resultatene viste at domenet eksisterer som en pentamer i løsning, med en omtrentlig molekylmasse på 58 kDa (figur 1A, B). Videre ble nukleoplasmindomenet analysert for termisk og kjemisk stabilitet i forbindelse med analytisk SEC. Nukleoplasminprøven utsatt for varmebehandling opp til 90 °C viste ingen tilsynelatende endring i elueringsvolumet og topphøyden sammenlignet med prøvene opprettholdt ved 20 °C, noe som tyder på at domenet er svært termostabilt (figur 1C). På samme måte viste nukleoplasmindomenet saltstabilitet opp til 2 M NaCl (figur 1D) og ureastabilitet opp til 4 M (figur 1E). Nukleoplasminpentameren begynte imidlertid å dissosiere i høyere ureakonsentrasjoner.

En nedtrekksanalyse ble utført for å bestemme typen interaksjoner som bidrar til den komplekse dannelsen mellom histon-chaperonet (nukleoplasmindomenet til AtFKBP53) og histonoligomerene H2A / H2B-dimer og H3 / H4-tetramer ved bruk av en gradient saltvask. Interaksjonen mellom nukleoplasmindomenet og H2A/H2B-dimer var stabil opp til en saltkonsentrasjon på 0,4 M NaCl (figur 2A). Til sammenligning var assosiasjonen med H3/H4 rimelig stabil opp til 0,7 M NaCl (figur 2B). Chaperone-histonkompleksenes evne til å motstå høy saltkonsentrasjon antyder rollen som hydrofobe interaksjoner i stabilisering av kompleksene. Chaperonekomplekset med H3 / H4 som er stabilt selv i høye saltkonsentrasjoner, antyder en dominerende rolle hydrofobe interaksjoner i den komplekse formasjonen. Den lavere stabiliteten til H2A/H2B-chaperonekomplekset i høye saltkonsentrasjoner avslører en betydelig rolle for elektrostatiske interaksjoner i den komplekse formasjonen. I et annet eksperiment ble nedtrekksanalysen brukt til å undersøke om chaperone foretrekker enten H2A / H2B dimer eller H3 / H4 tetramer. Resultatene viste at chaperone binder seg til H2A/H2B dimer og H3/H4 tetramer samtidig og uavhengig av i hvilken rekkefølge de legges til chaperone (figur 2C,D). Dette indikerte at chaperone har separate steder for samspillet med histonoligomerene.

AUC-SV-eksperimenter (figur 3) ble utført for å studere støkiometrien av interaksjon mellom histonoligomerer og chaperoner. AUC-SV dataanalyse ga en sedimentasjonskoeffisient (s) verdi på 5,40 S for AtFKBP53 nukleoplasmindomenet i kompleks med H2A / H2B som tilsvarte en molekylmasse på 104 kDa. Komplekset av nukleoplasmindomenet med H3 / H4 ga en sedimentasjonskoeffisientverdi på 7, 35 S, tilsvarende 129 kDa. Den estimerte molekylmassen til kompleksene avslører at pentamerisk nukleoplasmin danner kompleks med både H2A / H2B dimer og H3 / H4 tetramer i en 1: 1 støkiometri.

Det er viktig å vise at proteinet kan deponere histon oligomerer på DNA for å bekrefte at det er en histon chaperone. Mot dette formål ble en plasmid supercoiling assay vedtatt (figur 4). Det avslappede sirkulære plasmidet ble inkubert med histonoligomerene H2A/H2B og H3/H4 med de rekombinante plantehistonene i NAP-familien - AtNRP1 og AtNRP228. Tilstedeværelsen av chaperone økte mengden supercoiled plasmid, noe som tyder på at det kunne deponere histoner på DNA for å danne nukleosomer, noe som forårsaker DNA-supercoiling.

Figure 1
Figur 1: Oligomer tilstand og stabilitet av nukleoplasmindomenet til AtFBP53. (A) Analytisk størrelseseksklusjonskromatografiprofil for AtFKBP53 nukleoplasmindomenet. (B) Kalibreringskurve oppnådd ved bruk av kuleformede proteiner av kjent molekylmasse. De blå prikkene representerer molekylmassen til de kjente proteinene, mens den røde prikken representerer AtFKBP53 nukleoplasmindomenet. (440 kDa - ferritin, 158 kDa-aldolase, 75 kDa-con albumin, 44 kDa-ovalbumin, 6,5 kDa-aprotinin). (C) Analytisk størrelsesekskluderingskromatogram på 500 μL av 0,5 mg / ml AtFKBP53 nukleoplasmindomene utsatt for varmebehandling ved forskjellige temperaturer: 20 ° C (grønn), 40 ° C (oransje), 60 ° C (svart), 90 ° C (lyseblå). (D) Analytisk størrelsesekskluderingskromatogram på 500 μL av 0,5 mg / ml AtFKBP53 nukleoplasmindomene i buffere som inneholder forskjellige NaCl-konsentrasjoner: 0,3 M (lilla), 0,6 M (rød), 1,0 M (lyseblå), 1,5 M (grønn), 2,0 M (svart). (E) Analytisk størrelsesekskluderingskromatogram av AtFKBP53 nukleoplasmindomenet i buffere med forskjellige ureakonsentrasjoner: 0 M (kontroll; lyseblå), 1,0 M (rosa), 2,0 M (svart), 3,0 M (mørk blå), 4,0 M (grønn), 5,0 M (brun). Nukleoplasminpentameren viser høy stabilitet til termiske og kjemiske spenningsforhold. Figuren er tilpasset fra referanse21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Nedtrekksanalyser for samspillet mellom nukleoplasmindomenet til AtFKBP53 og histonoligomerer. 18% SDS-PAGE-bilder av elueringsfraksjonene fra analysene presenteres her. Nedtrekksanalyse for ( A ) 20 μM H2A/H2B dimer og (B) 20 μM H3/H4 tetramer med 5 μM AtFKBP53 nukleoplasmindomene i økende konsentrasjoner av NaCl i området 0,3 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M og 1,0 M. 5 μM AtFKBP53 FKBD ble brukt som en negativ kontroll her. For det konkurrerende bindingseksperimentet er ( C ) en blanding av 5 μM AtFKBP53 nukleoplasmindomene og 20 μM H3 / H4 tetramer inkubert med et område på 20-60 μM H2A / H2B dimer og (D) en blanding av 5 μM AtFKBP53 nukleoplasmindomene og 20 μM H2A / H2B dimer inkubert med et område på 20-60 μM H3 / H4 tetramer er brukt. Etiketten AtFKBP53 tilsvarer nukleoplasmindomenet til AtFKBP53. Elusjonsfraksjoner viser samtidig binding av begge histonoligomerene til nukleoplasminet. Figuren er tilpasset fra referanse21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Analytisk ultracentrifugering - sedimenteringshastighet (AUC-SV) eksperiment av histonoligomerer, nukleoplasmindomenet til AtFKBP53 og deres komplekser. AUC-avstandsfordelingen vs. sedimentasjonskoeffisient (S) plott. De oppnådde sedimentasjonskoeffisientverdiene (s) og molekylmassene er også gitt. Etiketten AtFKBP53 tilsvarer nukleoplasmindomenet til AtFKBP53. De estimerte molekylmassene avslører en 1:1 støkiometri for AtFKBP53 nukleoplasmindomenet med histonoligomerene H2A/H2B dimer og H3/H4 tetramer. 450 μL av alle proteinprøvene med OD280 på 0,3-0,5 ble brukt til AUC-SV-eksperimentene. Figuren er tilpasset fra referanse21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Plasmid supercoiling assay. Plasmid supercoiling analyse for histon chaperones AtNRP1 og AtNRP2. 500 ng pUC19 plasmid-DNA ble forbehandlet med 1 μg Topoisomerase I for forsøket. 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2, og en blanding av 4 μM H2A/H2B dimer og 2 μM H3/H4 tetramer var som kontroll som ikke viser supercoiling aktivitet når inkubert med forbehandlet pUC19 DNA. Banene med en blanding av 4 μM H2A / H2B dimer og 2 μM H3 / H4 tetramer og 4 μM hver av AtNRP1 og AtNRP2 viser dannelsen av supercoiled DNA ved inkubasjon med forbehandlet pUC19 DNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette arbeidet demonstrerer og validerer et omfattende sett med protokoller for biokjemisk og biofysisk karakterisering av en antatt histon chaperone. Her ble rekombinant uttrykt og renset NAP-familieproteiner, AtNRP1 og AtNRP2, og det N-terminale nukleoplasmindomenet til AtFKBP53 brukt til å demonstrere protokollene. Det samme settet av eksperimenter kan meget vel brukes til å avgrense de funksjonelle egenskapene til tidligere ukarakteriserte histon-chaperoner fra enhver organisme.

Den første delen av protokollseksjonen innebærer å undersøke den oligomere tilstanden og stabiliteten til en histon chaperone. Flere rapporter indikerer at histon-chaperones viser betydelig mangfold i deres oligomere tilstand. For eksempel eksisterer menneskelig CAF-1 som en monomer29. NAP familiemedlemmer eksisterer som dimer eller tetramer 29,30,31. Nukleoplasminer avslører pentamere og ofte dekameriske oligomere tilstander32,33. Et analytisk SEC-eksperiment kan bestemme den oligomere tilstanden til en histon-chaperon, og AUC-SV-eksperimenter kan bekrefte det samme. Flere av histon-chaperonene er kjent for å være svært stabile under ulike termiske og kjemiske spenningsforhold33,34. De termiske og kjemiske stabilitetsegenskapene til histon-chaperoner kan også utforskes i forbindelse med analytisk SEC. Videre kan sirkulær dikroismespektroskopi effektivt brukes til grundig analyse av endringene i chaperonens sekundære struktur når den blir utsatt for økende temperaturer eller høyere konsentrasjoner av et kjemisk middel.

Den andre delen av protokollseksjonen dekker nedtrekksanalyser som kan undersøke de grunnleggende interaksjonene som hjelper assosiasjonen av histonoligomerer med anstanden ved å bruke en saltgradienttilnærming og en konkurransedyktig nedtrekksanalyse for å identifisere histonoligomerpreferansen til en anstand. Hvis komplekset faller fra hverandre med en liten økning i saltkonsentrasjonen, vil det tyde på et stort bidrag av elektrostatiske interaksjoner for å stabilisere komplekset. Et intakt kompleks i høyt salt vil foreslå en betydelig rolle for hydrofobisitet i stabilisering av komplekset35. Den konkurrerende nedtrekksanalysen kan enkelt brukes til å bestemme spesifisiteten eller preferansen til en histon-chaperone til en bestemt histon-oligomerklasse. Basert på deres preferanse mot histon oligomerer, kan histon chaperones klassifiseres i tre kategorier som H2A / H2B chaperones, H3 / H4 chaperones, og H2A / H2B-H3 / H4 chaperones 10,36. I tillegg kan isotermisk titreringskalorimetri (ITC) om nødvendig brukes til å forstå histonoligomerspesifisiteten til en gitt chaperone og de termodynamiske egenskapene til deres interaksjoner.

Den tredje delen av protokolldelen dekker undersøkelsen av interaksjonsstøkiometrien mellom en histon-chaperone og histonoligomerene. Generelt er de forskjellige familiene av histon-chaperoner svært forskjellige for støkiometrien av deres tilknytning til H2A / H2B eller / og H3 / H4 21,28,37,38. AUC-SV-eksperimentet hjelper til med å oppnå sedimentasjonskoeffisient (er) og molekylmasse av et protein eller dets kompleks, noe som blir svært nyttig for nøyaktig estimering av støkiometrien i den komplekse formasjonen. Alternativt kan ITC også brukes til å undersøke støkiometri.

Den fjerde delen av protokollseksjonen fokuserer på å undersøke nukleosomets monteringsfunksjon av histon-chaperoner. Histon chaperones spiller en avgjørende rolle i nukleosommontering, som regulerer viktige cellulære prosesser som replikasjon, transkripsjon og DNA-reparasjon39. Plasmid supercoiling assay som vanligvis brukes til in vitro vurdering av histon chaperoning aktivitet av histon chaperones er utdypet i denne delen.

Det kan bemerkes at ikke alle histon chaperones er fullt strukturert. Få er kjent for å ha iboende uordnede regioner40,41. Derfor kan termiske og kjemiske stabilitetsanalyser ikke være egnet for slike proteiner. Videre har histon chaperones fra forskjellige organismer forskjellige oligomere tilstander og differensielle evner til å binde seg til histoner. Derfor kan denne protokollen være et godt utgangspunkt, men vil innebære endringer etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikt ble erklært.

Acknowledgments

De ekstramurale tilskuddene til Dileep Vasudevan fra Science and Engineering Research Board, Indias regjering [CRG/2018/000695/PS] og Institutt for bioteknologi, Ministry of Science and Technology, Indias regjering [BT/INF/22/SP33046/2019], samt intramural støtte fra Institute of Life Sciences, Bhubaneswar er sterkt anerkjent. Vi takker Sudeshna Sen og Annapurna Sahoo for deres hjelp med histonforberedelse. Diskusjonene med våre kolleger Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev, og Dr. Shaikh Nausad Hossain er også anerkjent.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Biokjemi utgave 178 Histon chaperon nukleosommontering kromatin nukleoplasmin NAP plasmid supercoiling analytisk ultracentrifugation
<em>In vitro</em> Karakterisering av Histone Chaperones ved hjelp av analytiske, nedtrekkbare og chaperoning analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral,… More

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter