Summary

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

Published: November 12, 2021
doi:

Summary

Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

Abstract

Devido à sua renomada capacidade regenerativa, os zebrafish adultos são um modelo de vertebrado premier para interrogar mecanismos de regeneração da medula espinhal inata. Após a transeção completa de sua medula espinhal, os zebrafish estendem pontes glial e axonal através do tecido cortado, regeneram neurônios proximal à lesão e recuperam suas capacidades de natação dentro de 8 semanas de lesão. A recuperação da função de natação é, portanto, uma leitura central para a reparação funcional da medula espinhal. Aqui, descrevemos um conjunto de ensaios comportamentais para quantificar a capacidade motora de zebrafish dentro de um túnel de natação fechado. O objetivo desses métodos é fornecer medidas quantificáveis de resistência à natação e comportamento de natação em zebrafish adultos. Para a resistência ao nado, os zebrafish são submetidos a uma velocidade de corrente de água em constante aumento até a exaustão, e o tempo de exaustão é relatado. Para avaliação do comportamento de natação, os zebrafish são submetidos a velocidades de baixa corrente e vídeos de natação são capturados com uma visão dorsal dos peixes. Por cento de atividade, frequência de explosão e tempo gasto contra a corrente de água fornecem leituras quantificáveis do comportamento de natação. Quantificamos a resistência ao nado e o comportamento de natação em zebrafish tipo selvagem antes da lesão e após a transeção da medula espinhal. Descobrimos que os zebrafish perdem a função de natação após a transeção da medula espinhal e gradualmente recuperam essa capacidade entre 2 e 6 semanas após a lesão. Os métodos descritos neste estudo poderiam ser aplicados a estudos neuroabáviois, musculoesqueléticos, regeneração muscular esquelética e regeneração neural em zebrafish adulto.

Introduction

Os zebrafish adultos são eminentemente usados para investigar mecanismos de desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético e modelagem de doenças1,2,3. Os zebrafish são capazes de reparar eficientes e espontâneos tecidos múltiplos, incluindo cérebro, medula espinhal e músculo esquelético4,5,6,7. A notável capacidade de regenerar tecidos neuromusculares e doenças modelo está atraindo uma comunidade científica crescente para pesquisas de zebrafish adulto1,2,3. No entanto, enquanto ensaios de locomoção e comportamento de natação estão disponíveis e padronizados para zebrafish larval, há uma necessidade crescente de desenvolver protocolos análogos em peixes adultos8,9,10,11. O objetivo deste estudo é descrever protocolos para quantificar a resistência à natação e o comportamento de natação em zebrafish adultos. Apresentamos esses protocolos no contexto da pesquisa de regeneração da medula espinhal. No entanto, os protocolos comportamentais descritos aqui são igualmente aplicáveis aos estudos de regeneração neural e muscular, desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético, bem como modelagem de doenças neuromusculares e musculoesqueléticos.

Zebrafish reverte paralisia dentro de 8 semanas de transeção completa da medula espinhal. Ao contrário dos mamíferos mal regenerativos, os zebrafish apresentam respostas de lesões imuno regenerativas, neuronais e glial que são necessárias para a reparação funcional da medula espinhal12,13,14. Uma leitura final da reparação funcional da medula espinhal é a capacidade do tecido lesado de recuperar sua função após a lesão. Um conjunto de métodos padronizados para avaliar a regeneração funcional em roedores inclui testes locomotor, motor, sensorial e sensorial15,16,17. Testes amplamente utilizados na lesão medular do rato incluem a escala de rato de basso locomotor (BMS), testes motores de membros dianteiros, testes sensoriais táteis e testes sensorimotores de caminhada na grade15,17. Em contraste com os sistemas de zebrafish mamíferos ou larvais, os testes comportamentais em zebrafish adultos são menos desenvolvidos, mas muito necessários para acomodar as crescentes necessidades das comunidades de regeneração tecidual e modelagem de doenças.

Transeções completas da medula espinhal resultam em paralisia completa caudal para o local da lesão. Logo após a lesão, os animais paralisados são menos ativos e evitam nadar o máximo possível. Para compensar a perda da capacidade de natação, os animais paralisados apresentam rajadas curtas e frequentes, usando demais suas barbatanas peitorais, que ficam rostral à lesão. Esta estratégia de natação compensatória resulta em exaustão rápida e menor capacidade de natação. À medida que a medula espinhal dos zebrafish se regenera, os animais recuperam uma função de natação oscilante suave caudal para a lesão, permitindo maior resistência à natação e melhores parâmetros de comportamento na natação. Aqui, descrevemos métodos para quantificar a resistência ao nado de zebrafish no aumento das velocidades de corrente de água e comportamento de natação em velocidades de baixa corrente.

Protocol

Zebrafish adultos das cepas Ekkwill e AB foram mantidos no Centro de Zebrafish da Universidade de Washington. Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com os protocolos institucionais de animais da IACUC. NOTA: Um exemplo da configuração experimental é mostrado na Figura 1A. A tampa de calibração (personalizada), a tampa de resistência ao natação (personalizada) e a tampa de comportamento de natação (tampa padrão e fechada do t?…

Representative Results

Montamos o túnel de natação como descrito na seção 1 deste protocolo (Figura 1). Avaliamos a resistência à natação (seção 2 deste protocolo) bem como o comportamento de natação (seções 3 e 4 deste protocolo) de zebrafish adulto na linha de base e após lesão medular (Figura 2). Para estabelecer a função motora da linha de base, examinamos a resistência ao nado de zebrafish tipo selvagem sob velocidades crescentes de…

Discussion

Os zebrafish adultos são um sistema de vertebrados popular para modelar doenças humanas e estudar mecanismos de regeneração tecidual. A edição do genoma CRISPR/Cas9 revolucionou estudos genéticos reversos para modelagem de doenças em zebrafish; no entanto, a genética em larga escala em zebrafish adulto tem sido dificultada por desafios biológicos e técnicos, incluindo a indisponibilidade de tecidos adultos de zebrafish para fenotipagem de alto rendimento. Dada a complexa anatomia dos zebrafish adultos, o proce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Recurso Compartilhado de Zebrafish da Universidade de Washington pelo cuidado com os animais. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).

Materials

AutoSwim software Loligo Systems MI10000 Optional – for Automatic control of current velocity
Customized lid Loligo Systems MI10001 This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT Loligo Systems SW10600 Optional – for Automatic control of current velocity
Eheim pump Loligo Systems PU10160 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji Fiji Freely available through Image J (Fiji) Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm Loligo Systems AC10000 Handheld digital flow meter – for calibration
High Speed Camera Loligo Systems VE10380 USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel Loligo Systems VE10775 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens Loligo Systems VE10388 25mm manual lens
PVC Tubing VWR 60985-534 5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio R Studio Freely available. Version 3.6 with extra packages. Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer Loligo Systems SW10060 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit IDS Freely available software to control camera parameters Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe Loligo Systems AC10002 Digital flow probe – for calibration

References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
  2. Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
  3. Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
  4. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  5. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  6. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  7. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
  8. Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
  9. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  10. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
  11. Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
  12. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  13. Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
  14. Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
  15. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
  16. Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
  17. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  18. Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
  19. Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
  20. Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
  21. Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
  22. Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
  23. Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).

Play Video

Cite This Article
Burris, B., Jensen, N., Mokalled, M. H. Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (177), e63240, doi:10.3791/63240 (2021).

View Video