הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים
Summary
דגי זברה בוגרים, המסוגלים להחלמה תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה, הם מערכת מודלים מובילה להבהרת מנגנונים מולדים של התחדשות עצבית. כאן, אנו מתארים סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדיקות כמו קריאות פונקציונליות של התחדשות חוט השדרה.
Abstract
בשל יכולת ההתחדשות המפורסמת שלהם, דגי זברה בוגרים הם מודל מוביל של בעלי חוליות לחקור מנגנונים של התחדשות מולדת של חוט השדרה. לאחר העברה מלאה של חוט השדרה שלהם, דגי זברה מרחיבים גשרי גליה ואקסונל על פני רקמות קטועות, מחדשים נוירונים קרובים לנגע, ומחזירים את יכולות השחייה שלהם תוך 8 שבועות מפציעה. התאוששות של תפקוד השחייה היא אפוא קריאה מרכזית לתיקון חוט השדרה תפקודי. כאן, אנו מתארים סדרה של בדיקות התנהגותיות כדי לכמת את יכולת המנוע של דגי הזברה בתוך מנהרת שחייה סגורה. מטרתן של שיטות אלה היא לספק מדידות הניתנות לכימות של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. עבור סיבולת שחייה, דגי זברה נתונים למהירות זרם מים גדלה כל הזמן עד תשישות, וזמן תשישות מדווח. להערכת התנהגות השחייה, דגי זברה נתונים למהירויות זרם נמוכות וסרטוני שחייה נלכדים עם מבט גב של הדגים. פעילות אחוזים, תדירות התפרצות וזמן שהושקע כנגד זרם המים מספקים קריאות הניתנות לכימות של התנהגות השחייה. כימתנו סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה מסוג בר לפני פציעה ואחרי מעבר חוט השדרה. גילינו שדגי זברה מאבדים את תפקוד השחייה לאחר מעבר חוט השדרה ומחזירים בהדרגה את היכולת הזו בין שבועיים לשישה שבועות לאחר הפציעה. השיטות המתוארות במחקר זה ניתן ליישם neurobehavioral, שרירים ושלד, התחדשות שרירי השלד, ומחקרי התחדשות עצבית בדגי זברה בוגרים.
Introduction
דגי זברה בוגרים משמשים באופן בולט כדי לחקור מנגנונים של התפתחות שרירית שרירית ושרירים ושלד ומודלים של מחלות 1,2,3. דגי זברה מסוגלים לבצע תיקון יעיל וספונטני של רקמות מרובות, כולל המוח, חוט השדרה ושרירי השלד4,5,6,7. היכולת המדהימה לחדש רקמות נוירו-שריריות ומחלות מודל מושכת קהילה מדעית הולכת וגדלה למחקר דגי זברה למבוגרים1,2,3. עם זאת, בעוד בדיקות של תנועה והתנהגות לשחות זמינים סטנדרטיים עבור דגי זברה זחליים, יש צורך גובר לפתח פרוטוקולים אנלוגיים דגים בוגרים8,9,10,11. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקולים לכמת סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים. אנו מציגים פרוטוקולים אלה בהקשר של מחקר התחדשות חוט השדרה. עם זאת, הפרוטוקולים ההתנהגותיים המתוארים כאן ישימים באותה מידה למחקרים של התחדשות עצבית ושרירים, התפתחות עצבית שרירית ושרירים ושלד, כמו גם מודלים של מחלות שריריות ושרירים ושלד.
שיתוק הפוך של דגי זברה תוך 8 שבועות מהעברת חוט השדרה המלאה. שלא כמו יונקים מתחדשים בצורה גרועה, דגי זברה מציגים תגובות לפגיעה חיסונית, עצבית וגלייתית פרו-רגנרטיביות הנדרשות לתיקון תפקודי של חוט השדרה 12,13,14. קריאה אולטימטיבית של תיקון חוט השדרה תפקודי היא היכולת של הרקמה הנגעה לחזור לתפקודה לאחר פציעה. חבילה של שיטות סטנדרטיות להערכת התחדשות תפקודית במכרסמים כוללת בדיקות לוקומוטור, מנוע, חושים וסנסימוטורים15,16,17. בדיקות נפוצות בפגיעה בחוט השדרה של העכבר כוללות את סולם העכברים של לוקומוטור באסו (BMS), בדיקות מוטוריות מקדימות, בדיקות חושיות מישוש ובדיקות סנסורימוטורי הליכה ברשת15,17. בניגוד למערכות של דגי זברה יונקים או זחלים, בדיקות התנהגותיות בדגי זברה בוגרים פחות מפותחות, אך נחוצות מאוד כדי להתאים לצרכים הגדלים של קהילות התחדשות הרקמות ומודול מחלות.
עבירות שלמות בחוט השדרה גורמות לשיתוק מוחלט באתר הפציעה. זמן קצר לאחר הפציעה, בעלי חיים משותקים פחות פעילים ונמנעים משחייה ככל האפשר. כדי לפצות על אובדן כושר השחייה, בעלי חיים משותקים מציגים התפרצויות קצרות ותכופות על ידי שימוש יתר בסנפירי החזה שלהם, השוכנים רוסטרלי לנגע. אסטרטגיית שחייה מפצה זו גורמת לתשישות מהירה ולקיבולת שחייה נמוכה יותר. ככל שחוט השדרה של דגי הזברה מתחדש, בעלי החיים חוזרים לתפקוד שחייה תנודתי חלק עד הנגע, מה שמאפשר סיבולת שחייה מוגברת ופרמטרים משופרים של התנהגות השחייה. כאן, אנו מתארים שיטות לכמת סיבולת שחייה של דגי זברה בהגדלת מהירויות זרם המים והתנהגות השחייה במהירויות זרם נמוכות.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגי זברה בוגרים הם מערכת חוליות פופולרית למידול מחלות אנושיות ולחקר מנגנונים של התחדשות רקמות. עריכת הגנום CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקרים גנטיים הפוכים למידול מחלות בדגי זברה; עם זאת, גנטיקה בקנה מידה גדול בדגי זברה בוגרים הופרעה על ידי אתגרים ביולוגיים וטכניים, כולל אי זמינות של רקמות דגי זב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למשאב המשותף של דגי הזברה של אוניברסיטת וושינגטון לטיפול בבעלי חיים. מחקר זה נתמך על ידי NIH (R01 NS113915 ל- M.H.M).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
