Valutazione della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto
Summary
Capace di recupero funzionale dopo lesioni del midollo spinale, il pesce zebra adulto è un sistema modello premier per chiarire i meccanismi innati di rigenerazione neurale. Qui, descriviamo la resistenza al nuoto e i saggi di comportamento del nuoto come letture funzionali della rigenerazione del midollo spinale.
Abstract
Grazie alla loro rinomata capacità rigenerativa, i pesci zebra adulti sono un modello di vertebrato di prim’ordine per interrogare i meccanismi di rigenerazione innata del midollo spinale. Dopo la completa trasezione del midollo spinale, i pesci zebra estendono i ponti gliali e assonali attraverso il tessuto reciso, rigenerano i neuroni prossimali alla lesione e riacquistano le loro capacità di nuoto entro 8 settimane dalla lesione. Il recupero della funzione di nuoto è quindi una lettura centrale per la riparazione funzionale del midollo spinale. Qui, descriviamo una serie di saggi comportamentali per quantificare la capacità motoria del pesce zebra all’interno di un tunnel di nuoto chiuso. L’obiettivo di questi metodi è quello di fornire misurazioni quantificabili della resistenza al nuoto e del comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto. Per la resistenza al nuoto, i pesci zebra sono sottoposti a una velocità di corrente dell’acqua in costante aumento fino all’esaurimento e viene riportato il tempo all’esaurimento. Per la valutazione del comportamento di nuoto, i pesci zebra sono soggetti a basse velocità di corrente e i video di nuoto vengono catturati con una vista dorsale del pesce. L’attività percentuale, la frequenza di scoppio e il tempo trascorso contro la corrente dell’acqua forniscono letture quantificabili del comportamento del nuoto. Abbiamo quantificato la resistenza al nuoto e il comportamento di nuoto nel pesce zebra selvatico prima dell’infortunio e dopo la trasduzione del midollo spinale. Abbiamo scoperto che il pesce zebra perde la funzione di nuoto dopo la traslazione del midollo spinale e gradualmente riacquista quella capacità tra 2 e 6 settimane dopo l’infortunio. I metodi descritti in questo studio potrebbero essere applicati a studi di rigenerazione neurocomportamentale, muscolo-scheletrica, muscolare scheletrica e di rigenerazione neurale nel pesce zebra adulto.
Introduction
I pesci zebra adulti sono eminentemente utilizzati per studiare i meccanismi di sviluppo neuromuscolare e muscolo-scheletrico e la modellazione della malattia1,2,3. I pesci zebra sono in grado di riparare in modo efficiente e spontaneo più tessuti, tra cui il cervello, il midollo spinale e il muscolo scheletrico4,5,6,7. La notevole capacità di rigenerare i tessuti neuromuscolari e le malattie modello sta attirando una crescente comunità scientifica nella ricerca sul pesce zebra adulto1,2,3. Tuttavia, mentre i saggi di locomozione e comportamento di nuoto sono disponibili e standardizzati per il pesce zebra larvale, vi è una crescente necessità di sviluppare protocolli analoghi nei pesci adulti8,9,10,11. L’obiettivo di questo studio è descrivere i protocolli per quantificare la resistenza al nuoto e il comportamento di nuoto nel pesce zebra adulto. Presentiamo questi protocolli nel contesto della ricerca sulla rigenerazione del midollo spinale. Tuttavia, i protocolli comportamentali qui descritti sono ugualmente applicabili agli studi di rigenerazione neurale e muscolare, sviluppo neuromuscolare e muscolo-scheletrico, nonché modelli di malattie neuromuscolari e muscoloscheletriche.
Zebrafish inverte la paralisi entro 8 settimane dalla completa traslazione del midollo spinale. A differenza dei mammiferi scarsamente rigenerativi, i pesci zebra mostrano risposte immunitarie, neuronali e gliali pro-rigenerative necessarie per la riparazione funzionale del midollo spinale12,13,14. Una lettura definitiva della riparazione funzionale del midollo spinale è la capacità del tessuto lesionato di riacquistare la sua funzione dopo la lesione. Una serie di metodi standardizzati per valutare la rigenerazione funzionale nei roditori include test locomotori, motori, sensoriali e sensomotori15,16,17. I test ampiamente utilizzati nelle lesioni del midollo spinale del topo includono la basso mouse scale locomotoria (BMS), i test motori degli arti anteriori, i test sensoriali tattili e i test sensomotori di camminata a griglia15,17. A differenza dei sistemi di zebrafish mammiferi o larvali, i test comportamentali nei pesci zebra adulti sono meno sviluppati, ma molto necessari per soddisfare le crescenti esigenze delle comunità di rigenerazione dei tessuti e di modellazione delle malattie.
Le trasmissioni complete del midollo spinale provocano una paralisi completa caudale al sito della lesione. Poco dopo l’infortunio, gli animali paralizzati sono meno attivi ed evitano di nuotare il più possibile. Per compensare la perdita di capacità di nuoto, gli animali paralizzati mostrano brevi e frequenti esplosioni abusando delle loro pinne pettorali, che giacciono rostrali alla lesione. Questa strategia di nuoto compensativa si traduce in un rapido esaurimento e in una minore capacità di nuoto. Man mano che il midollo spinale del pesce zebra si rigenera, gli animali riacquistano una funzione di nuoto oscillatorio liscia caudale alla lesione, consentendo una maggiore resistenza al nuoto e migliori parametri di comportamento del nuoto. Qui, descriviamo i metodi per quantificare la resistenza al nuoto del pesce zebra all’aumentare le velocità della corrente d’acqua e il comportamento del nuoto a basse velocità attuali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I pesci zebra adulti sono un popolare sistema di vertebrati per modellare le malattie umane e studiare i meccanismi di rigenerazione dei tessuti. L’editing del genoma CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato gli studi genetici inversi per la modellazione della malattia nel pesce zebra; tuttavia, la genetica su larga scala nel pesce zebra adulto è stata ostacolata da sfide biologiche e tecniche, tra cui l’indisponibilità dei tessuti di zebrafish adulti alla fenotipizzazione ad alto rendimento. Data la complessa anatomia del pesce z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Washington University Zebrafish Shared Resource per la cura degli animali. Questa ricerca è stata supportata dal NIH (R01 NS113915 to M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
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