Оценка выносливости при плавании и поведения в плавании у взрослых рыбок данио
Summary
Способная к функциональному восстановлению после травмы спинного мозга, взрослая рыбка данио является ведущей модельной системой для выяснения врожденных механизмов нервной регенерации. Здесь мы описываем анализы на выносливость плавания и поведение в плавании как функциональные показания регенерации спинного мозга.
Abstract
Благодаря своей известной регенеративной способности, взрослые рыбки данио являются ведущей моделью позвоночных для изучения механизмов врожденной регенерации спинного мозга. После полной трансекции спинного мозга рыбки данио расширяют глиальные и аксональные мосты через разорванную ткань, регенерируют нейроны, близкие к поражению, и восстанавливают свои плавательные способности в течение 8 недель после травмы. Таким образом, восстановление функции плавания является центральным считыванием для функционального восстановления спинного мозга. Здесь мы описываем набор поведенческих анализов для количественной оценки двигательной способности рыбок данио внутри закрытого плавательного туннеля. Целью этих методов является обеспечение количественных измерений выносливости плавания и плавательного поведения у взрослых рыбок данио. Для выносливости в плавании рыбок данио подвергают постоянно увеличивающейся скорости течения воды до истощения, а также сообщается время при истощении. Для оценки поведения в плавании рыбок данио подвергаются скоростям низкого течения, а видео плавания захватываются с дорсальным видом рыбы. Процент активности, частота всплесков и время, проведенное против течения воды, обеспечивают количественное считывание поведения при плавании. Мы количественно оценили выносливость в плавании и поведение в плавании у рыбок данио дикого типа до травмы и после трансекции спинного мозга. Мы обнаружили, что рыбки данио теряют функцию плавания после трансекции спинного мозга и постепенно восстанавливают эту способность между 2 и 6 неделями после травмы. Методы, описанные в этом исследовании, могут быть применены к нейроповеденческим, скелетно-мышечным, скелетным мышцам и исследованиям нейронной регенерации у взрослых рыбок данио.
Introduction
Взрослые рыбки данио широко используются для исследования механизмов нервно-мышечного и опорно-двигательного развития и моделирования заболеваний1,2,3. Рыбки данио способны к эффективному, спонтанному восстановлению нескольких тканей, включая головной, спинной мозг и скелетные мышцы4,5,6,7. Замечательная способность регенерировать нервно-мышечные ткани и моделировать заболевания привлекает растущее научное сообщество к исследованиям взрослых рыбок данио1,2,3. Однако, в то время как анализы локомоции и плавательного поведения доступны и стандартизированы для личинок рыбок данио, существует растущая потребность в разработке аналогичных протоколов у взрослых рыб8,9,10,11. Целью этого исследования является описание протоколов для количественной оценки выносливости плавания и поведения в плавании у взрослых рыбок данио. Мы представляем эти протоколы в контексте исследований регенерации спинного мозга. Однако описанные здесь поведенческие протоколы в равной степени применимы к исследованиям нервной и мышечной регенерации, нервно-мышечного и опорно-двигательного развития, а также моделирования нервно-мышечных и костно-мышечных заболеваний.
Реверсивный паралич рыбок данио в течение 8 недель после полной трансекции спинного мозга. В отличие от плохо регенеративных млекопитающих, рыбки данио демонстрируют прорегенеративные иммунные, нейрональные и глиальные травмы, которые необходимы для функционального восстановления спинного мозга12,13,14. Окончательным показателем функционального восстановления спинного мозга является способность пораженной ткани восстанавливать свою функцию после травмы. Набор стандартизированных методов оценки функциональной регенерации у грызунов включает локомоторные, моторные, сенсорные и сенсомоторные тесты15,16,17. Широко используемые тесты при травме спинного мозга мыши включают локомоторную шкалу Basso Mouse Scale (BMS), моторные тесты передней конечности, тактильные сенсорные тесты и сенсомоторные тесты с сеткой ходьбы15,17. В отличие от систем данио млекопитающих или личинок, поведенческие тесты у взрослых рыбок данио менее развиты, но очень необходимы для удовлетворения растущих потребностей сообществ регенерации тканей и моделирования заболеваний.
Полные трансекции спинного мозга приводят к полному параличу каудально к месту травмы. Вскоре после травмы парализованные животные менее активны и избегают плавания, насколько это возможно. Чтобы компенсировать потерянную способность плавать, парализованные животные демонстрируют короткие, частые всплески, злоупотребляя своими грудными плавниками, которые лежат рострально к поражению. Эта компенсаторная стратегия плавания приводит к быстрому истощению и снижению плавательной способности. По мере регенерации спинного мозга рыбок данио животные восстанавливают плавную колебательную функцию плавания каудально к поражению, что позволяет повысить выносливость при плавании и улучшить параметры плавательного поведения. Здесь мы описываем методы количественной оценки выносливости рыбок данио при увеличении скоростей течения воды и плавательного поведения при низких скоростях течения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Взрослые рыбки данио являются популярной позвоночной системой для моделирования заболеваний человека и изучения механизмов регенерации тканей. Редактирование генома CRISPR/Cas9 произвело революцию в обратных генетических исследованиях для моделирования заболеваний у рыбок данио; однак…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Вашингтонского университета Zebrafish Shared Resource за уход за животными. Это исследование было поддержано NIH (R01 NS113915 до M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
