Bedömning av simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk
Summary
Kan funktionell återhämtning efter ryggmärgsskada, vuxna zebrafisk är ett främsta modellsystem för att klargöra medfödda mekanismer för neural regenerering. Här beskriver vi simning uthållighet och simning beteende analyser som funktionella avläsningar av ryggmärgsregenerering.
Abstract
På grund av deras berömda regenerativa kapacitet är vuxna zebrafiskar en främsta ryggradsmodell för att förhöra mekanismer för medfödd ryggmärgsregenerering. Efter fullständig transection av ryggmärgen, zebrafish förlänga glia och axonal broar över avhuggna vävnad, regenerera nervceller proximal till lesion och återfå sin simning kapacitet inom 8 veckor efter skada. Återhämtning av simfunktionen är således en central avläsning för funktionell ryggmärgsreparation. Här beskriver vi en uppsättning beteendeanalyser för att kvantifiera zebrafiskmotorkapaciteten inuti en sluten simtunnel. Målet med dessa metoder är att tillhandahålla kvantifierbara mätningar av simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk. För simning uthållighet utsätts zebrafisk för en ständigt ökande vattenströmhastighet tills utmattning och tid vid utmattning rapporteras. För bedömning av simbeteende utsätts zebrafisk för låg strömhastighet och simvideor fångas med en dorsal vy över fisken. Procentaktivitet, burst-frekvens och tid som spenderas mot vattenströmmen ger kvantifierbara avläsningar av simbeteende. Vi kvantifierade simning uthållighet och simning beteende i vilda-typ zebrafisk före skada och efter ryggmärgen transection. Vi fann att zebrafisk förlorar simfunktion efter ryggmärgstransection och gradvis återfå den kapaciteten mellan 2 och 6 veckor efter skada. De metoder som beskrivs i denna studie kan tillämpas på neurobehavioral, muskuloskeletal, skelettmuskulatur regenerering och neurala regenerering studier i vuxna zebrafisk.
Introduction
Vuxna zebrafiskar används i högsta grad för att undersöka mekanismer för neuromuskulär och muskuloskeletal utveckling och sjukdomsmodellering1,2,3. Zebrafisk kan effektivt, spontant reparera flera vävnader, inklusive hjärnan, ryggmärgen och skelettmuskeln4,5,6,7. Den anmärkningsvärda kapaciteten att regenerera neuromuskulära vävnader och modellsjukdomar lockar ett växande vetenskapligt samhälle till vuxen zebrafiskforskning1,2,3. Men medan analyser av rörelse och badbeteende finns tillgängliga och standardiseras för larv zebrafisk, finns det ett växande behov av att utveckla analoga protokoll hos vuxna fiskar8,9,10,11. Målet med denna studie är att beskriva protokoll för att kvantifiera simning uthållighet och simning beteende hos vuxna zebrafisk. Vi presenterar dessa protokoll i samband med ryggmärgsregenerering forskning. De beteendemässiga protokoll som beskrivs här är dock lika tillämpliga på studier av neurala och muskel regenerering, neuromuskulära och muskuloskeletala utveckling, liksom neuromuskulära och muskuloskeletala sjukdom modellering.
Zebrafish omvänd förlamning inom 8 veckor efter fullständig ryggmärgstransection. Till skillnad från dåligt regenerativa däggdjur visar zebrafisk proregenererande immun-, neuronal- och gliaskada svar som krävs för funktionell ryggmärg reparation12,13,14. En ultimat avläsning av funktionella ryggmärg reparation är förmågan hos lesionerade vävnad att återfå sin funktion efter skada. En serie standardiserade metoder för att bedöma funktionell regenerering hos gnagare inkluderar lokomotoriska, motoriska, sensoriska och sensorimotoriska tester15,16,17. Allmänt använda tester i mus ryggmärgsskada inkluderar lokomotor Basso Mouse Scale (BMS), forelimb motor tester, taktila sensoriska tester och grid walking sensorimotor tester15,17. I motsats till däggdjur eller larv zebrafisksystem är beteendetester hos vuxna zebrafiskar mindre utvecklade, men ändå välbehövliga för att tillgodose de växande behoven hos vävnadsregenererings- och sjukdomsmodelleringssamhällena.
Kompletta ryggmärgstransections resulterar i fullständig förlamning caudal till skadeplatsen. Kort efter skadan är förlamade djur mindre aktiva och undviker att simma så mycket som möjligt. För att kompensera för förlorad simkapacitet visar förlamade djur korta, frekventa utbrott genom att överanvända sina bröstfenor, som ligger rostral till lesion. Denna kompensatoriska simstrategi resulterar i snabb utmattning och lägre simkapacitet. När zebrafisk ryggmärgen regenererar, djur återfår en smidig oscillatory simning funktion caudal till lesion, vilket möjliggör ökad simning uthållighet och förbättrade simning beteende parametrar. Här beskriver vi metoder för att kvantifiera zebrafisk simma uthållighet vid ökande vattenström hastigheter och simma beteende vid låg ström hastigheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vuxna zebrafiskar är ett populärt ryggradssystem för modellering av mänskliga sjukdomar och studiemekanismer för vävnadsregenerering. CRISPR/Cas9 genomredigering har revolutionerat omvända genetiska studier för modellering av sjukdomar hos zebrafisk; Storskalig genetik hos vuxna zebrafiskar har dock hindrats av biologiska och tekniska utmaningar, inklusive otillgängligheten av vuxna zebrafiskvävnader för fenotypning med hög genomströmning. Med tanke på den komplexa anatomin hos vuxna zebrafiskar krävs lån…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Washington University Zebrafish Shared Resource för djurvård. Denna forskning stöddes av NIH (R01 NS113915 till M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Neuronal regeneration from ependymo-radial glial cells: cook, little pot, cook. Developmental Cell. 32 (4), 516-527 (2015).
- Mokalled, M. H., Poss, K. D. A regeneration toolkit. Developmental Cell. 47 (3), 267-280 (2018).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmental Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (23), 10545-10549 (1995).
- Moens, C. B., Yan, Y. L., Appel, B., Force, A. G., Kimmel, C. B. Valentino: a zebrafish gene required for normal hindbrain segmentation. Development. 122 (12), 3981-3990 (1996).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Klatt Shaw, D., et al. Localized EMT reprograms glial progenitors to promote spinal cord repair. Developmental Cell. 56 (5), 613-626 (2021).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Fatemi, G., Faden, A. I. A combined scoring method to assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neuroscience Research. 67 (2), 117-125 (2010).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Scheff, S. W., Saucier, D. A., Cain, M. E. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score. Journal of Neurotrauma. 19 (10), 1251-1260 (2002).
- Li, Q., et al. Differential behavioral responses of zebrafish larvae to yohimbine treatment. Psychopharmacology (Berl). 232 (1), 197-208 (2015).
- Wakamatsu, Y., Ogino, K., Hirata, H. Swimming capability of zebrafish is governed by water temperature, caudal fin length and genetic background. Scientific Reports. 9 (1), 16307 (2019).
- Ahmed, O., Seguin, D., Gerlai, R. An automated predator avoidance task in zebrafish. Behavioral Brain Research. 216 (1), 166-171 (2011).
- Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 87 (5), 1219-1233 (2015).
- Leris, I., Sfakianakis, D. G., Kentouri, M. Are zebrafish Danio rerio males better swimmers than females. Journal of Fish Biology. 83 (5), 1381-1386 (2013).
