ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Summary

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג’ל SDS-PAGE.

Abstract

מטריצה metalloproteinases (MMPs) שייכים למשפחה של פרוטאזים מצינזין עם תפקידים מרכזיים מטריצה חוץ תאית (ECM) השפלה ושיפוץ, כמו גם אינטראקציות עם מספר גורמי גדילה וציטוקינים. ביטוי יתר של MMPs ספציפיים אחראי במספר מחלות כגון סרטן, מחלות ניווניות ומחלות לב וכלי דם. MMPs היו מרכז תשומת הלב לאחרונה כמטרות לפתח טיפולית שיכולה לטפל במחלות בקורלציה MMP overexpression.

כדי ללמוד את מנגנון ה- MMP בפתרון, נדרשות שיטות ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיות מקלות וחזקות יותר לייצור MMPs פעילים ומסיסים יותר. עם זאת, התחום הקטליטי של רוב MMPs לא יכול לבוא לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורה מסיסת בשל חוסר מכונות פוסט-טרנסלטיות, בעוד מערכות ביטוי יונקים הם בדרך כלל יקרים ויש להם תשואות נמוכות יותר. גופי הכללת MMP חייבים לעבור את התהליך המייגע והמייגע של טיהור נרחב ושיפוץ מחדש, מה שמפחית באופן משמעותי את התשואה של MMPs בקונפורמציה מקומית. מאמר זה מציג פרוטוקול באמצעות Rosetta2(DE3)pLysS (להלן R2DP) תאים כדי לייצר מטריצה metalloproteinase-3 תחום קטליטי (MMP-3cd), המכיל N-מסוף His-tag ואחריו pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) לשימוש בטיהור זיקה. תאי R2DP משפרים את הביטוי של חלבונים אאוקריוטים באמצעות פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים נדירים בדרך כלל במערכות ביטוי חיידקיות. בהשוואה לקו התא המסורתי המועדף על ביטוי חלבון רקומביננטי, BL21(DE3), טיהור באמצעות זן חדש זה שיפר את התשואה של Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר. לאחר ההפעלה וההתפלה, התחום המקצועי נבקע יחד עם ה- N-terminal His-tag, ומספק MMP-3cd פעיל לשימוש מיידי באינספור יישומי הפריה חוץ גופית . שיטה זו אינה דורשת ציוד יקר או חלבוני היתוך מורכבים ומתארת ייצור מהיר של MMPs אנושיים רקומביננטיים בחיידקים.

Introduction

רוב החלבונים האוקריוטים המורכבים עוברים שינויים פוסט-טרנסליים מורכבים לאחר ההבעה, הדורשים קיפול חלבונים בסיוע גבוה וגורמים משותפים כדי להיות ^{פונקציונליים1}. ייצור כמויות גדולות של חלבון אנושי מסיס בפונדקאי חיידקי נותר אתגר משמעותי בשל עלויות גבוהות והיעדר שיטות ביטוי וטיהור חזקות, אפילו לניסויי מעבדה בקנה מידה קטן ^יותר2,3. MMPs, אנדופטידסים אנושיים עם משקל מולקולרי גדול, מתבטאים בדרך כלל כגופי הכללה בלתי מסיסים כאשר הם באים לידי ביטוי ב– E. coli. הפקת MMPs אנושיים מסיסים מובילה לעתים קרובות לתהליך solubilization מייגע וגוזל זמן ^רב4.

ל- MMPs יש תפקידים קריטיים הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בתהליכים פתוגניים. MMPs אנושיים הם משפחה של 23 אנדופטידסים אבץ, מסווגים לפי מבנה ומצע ספציפיים, ובאים לידי ביטוי דיפרנציאלי למרות תחום קטליטי שמור מאוד ^5,6. MMPs מופרשים כמו זימוגנים לא פעילים, מוסדר באמצעות הפעלה פוסט-טרנסלטית ומעכבים אנדוגני שלהם, מעכבי רקמות של metalloproteinases (TIMPs)7,8,9,10. למרות שהוכרו בתחילה על תפקידם במחזור ECM, MMPs היו מעורבים גם בפיתוח, מורפוגנזה, תיקון רקמות, ^{ושיפוץ8}. Dysregulation של MMPs נקשרה באופן בולט לסרטן יחד עם מחלות ניווניות, לב וכלי דם, פיברוטיות, בין מחלות ^{אחרות5,7}.

הפיתוח של שיטות ייצור MMP חזקות בקנה מידה גדול הוא קריטי כדי להבטיח את הצלחתם של מחקרים עתידיים של מנגנוני MMP באמצעות בדיקות ביוכימיות ומבוססות תאים. MMPs שונים התבטאו בעבר ^{בחיידקים11}, כולל MMPs מתויגים Hisx6, מבלי לשנות את פעילות ה- MMP12,13,14,15. עם זאת, שיטות אלה כוללות צעדים מייגעים וארוכים שעשויים להיות קשים לשכפול.

תאי יונקים יכולים לשמש גם כדי לבטא חלבונים אנושיים רבים ושונים תוך הבטחת השינויים הפוסט-טרנסליים ^{הנכונים16}. למרות שמערכת הביטוי של היונקים היא בחירה אידיאלית לייצר חלבונים אנושיים רקומביננטיים עם שינויים נכונים לאחר התרגום, החסרונות העיקריים של שיטה זו הם תשואות נמוכות ראשוניות, מדיה צמיחה יקרה ורגנטים, צירי זמן ארוכים כדי להגיע לקווי ביטוי יציבים, וסיכון לזיהום עם מינים אחרים כגון פטריות או ^{חיידקים2,11} . יתר על כן, ייצור MMP בשורות תאי יונקים מניב זיהומים מחלבונים תאיים הקשורים כגון TIMPs או ^{פיברונקטין11}. שלא כמו צמיחת התאים האיטית שנצפתה בתאי יונקים, מערכת הביטוי החיידקית מציעה ייצור חלבון בקנה מידה גדול בפרק זמן קצר יחד עם מדיה פשוטה יותר ודרישות צמיחה. עם זאת, בשל היעדר חלבונים תאיים אחרים הקשורים (כלומר, TIMPs) במערכות ביטוי חיידקי, MMPs פעיל בריכוזים גבוהים יותר כפופים השפלה באמצעות autoproteolysis, וכתוצאה מכך תשואה MMP ^ירודה17.

מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לביטוי חיידקי, טיהור והפעלה של Hisx6-pro-MMP-3cd רקומביננטי באמצעות E. coli כפונדקאי ביטוי בשל סבירותו, פשטותו, והצלחה בהפקת תשואות גבוהות יותר של MMPs2,3,18. מאז E. coli חסר את מכונות קיפול חלבון ועיבוד פוסט-טרנסלנטי הנדרש עבור MMPs רקומביננטי וחלבונים מורכבים אחרים, זנים רבים E. coli תוכננו כדי להתגבר על מגבלות אלה, מה שהופך את E. coli פונדקאי מתאים יותר לביטוי של MMP-3cd אנושי רקומביננטי, ^19,20 . לדוגמה, זן R2DP המשמש במחקר זה משפר את הביטוי האוקריוטי על ידי אספקת פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים המשמשים לעתים רחוקות E. coli.

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, לאחר הבעת יתר של גופי הכללה טהורים יחסית מווקטור pET-3a (איור 1) בתאי R2DP, חלבוני Hisx6-pro-MMP-3 קטליטי (MMP-3cd) מופקים ומנוטרלים4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 היה מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה תג זיקה. לאחר refolding ודיאליזה, pro-MMP-3cd (זימוגן) הופעל על ידי אצטט 4-aminophenylmercuric (APMA), וניתוח SDS-PAGE משמש להערכת התשואות ואת הצורך בטיהור ^נוסף5,21. פרוטוקול זה מתאר ביטוי, טיהור והפעלה של MMP-3cd מסיס כדוגמה. עם זאת, הוא עשוי לשמש גם כמדריך לביטוי של MMPs ופרוטאזים אנושיים אחרים עם ביטוי דומה, ומנגנוני הפעלה (איור 2). עבור חלבונים אחרים שאינם MMP-3cd, הקורא מומלץ לקבוע קומפוזיציות חיץ אופטימליות ושיטות עבור חלבון היעד שלהם לפני ניסיון פרוטוקול זה.

איור 1: מפת פלסמיד של הפלסמיד pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. וקטור pET-3a כולל גן עמידות אמפיצילין. רצף תגים מסוג N-terminal Hisx6 משוכפל לתוך וקטור מבוסס pET-3a, כולל פרו-MMP-3cd, כדי להניב את המבנה pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd תחת שליטה של מקדם T7 בין אתרי ההגבלה BamHI ו- NdeI. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ביטוי חיידקי של פלסמיד פרו-MMP-3cd, טיהור, שכפול מחדש והפעלה. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd פלסמיד הפך לתאי BL21(DE3) או R2DP. 1.2: ביטוי חלבון פרו-MMP-3cd הושרה באמצעות IPTG. 1.3: תמוגה כימית ו sonication משמשים כדי לחלץ Hisx6-pro-MMP-3cd חלבונים כי הם בעיקר מסיסים ונמצאים בגופי ההכללה. אוריאה שימשה כדי denature ו solubilize חלבון מגופי הכללה. 2.1. חלבון Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר באמצעות טיהור כרומטוגרפיה של זיקה. 3. Hisx6-pro-MMP-3cd המנוטרל נפרש לאט במהלך דיאליזה באמצעות הסרה הדרגתית של אוריאה מהחוצץ. 4. לבסוף, חלבון MMP-3cd משוחזר הופעל באמצעות APMA על ידי הסרת תחום N-מסוף פרו פפטיד. APMA מוסר מאוחר יותר מהפתרון באמצעות התפלה. המספרים תואמים למקטעי פרוטוקול המתארים שלבים אלה. קיצורים: MMP-3cd = מטריקס metalloproteinase-3 תחום קטליטי; APMA = אצטט 4-אמינופניל-מרקורי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. ביטוי MMP שיבוט וטרנספורמציה של pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd לתאי R2DP לעכל את pET-3a plasmid (ראה את טבלת החומרים) עם אנזימי הגבלה NdeI ו BamHI ב Digest Buffer (ראה טבלת החומרים). בנפח תגובה כולל של 40 μL, להוסיף 4 μL של מאגר תקציר, 33 μL של 100 ng / μL plasmid, ו 1.5 μL של כל אנזים הגבלה ולאפשר את התגובה ל?…

Representative Results

בעת הפעלת דגימות על SDS-PAGE, כי החלבון מתבטא בצורה של גופי הכללה מסיסים, שברי lysed ו sonicated צריך להכיל מעט מאוד תמצית Hisx6-pro-MMP-3cd, כמו החלבון עדיין לא היה resolubilized ב אוריאה. איור 3 משווה את שברי הארכת הטיהור של His-tag של Hisx6-pro-MMP-3cd מתאי BL21(DE3) ותאי R2DP. שברי Elution אוגדו בנפרד עבור תאי BL21(DE3) ו- R2DP…

Discussion

הייצור בקנה מידה גדול של MMPs מסיסים, אנושיים, רקומביננטיים נשאר משימה מאתגרת. תאי יונקים יכולים לבטא MMPs פונקציונליים בעלויות גבוהות וזמני המתנה ארוכים, ואילו E. coli מייצר במהירות כמויות גבוהות של גופי הכללת MMP שיש לטהר ולטפח מחדש ^11,16. תאי R2DP מגדילים באופן מ…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3