Summary

التعبير البكتيري وتنقية ميتالوبروتيناز المصفوفة البشرية -3 باستخدام كروماتوغرافيا التقارب

Published: March 30, 2022
doi:

Summary

يتم استخدام تنقية علامته وغسيل الكلى والتنشيط لزيادة غلة التعبير عن بروتين المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 القابل للذوبان والنشط في البكتيريا. يتم تحليل كسور البروتين عبر المواد الهلامية SDS-PAGE.

Abstract

تنتمي المصفوفة الميتالوبروتيناز (MMPs) إلى عائلة بروتياز الميتزينسين مع أدوار مركزية في تحلل وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، بالإضافة إلى التفاعلات مع العديد من عوامل النمو والسيتوكينات. الإفراط في التعبير عن MMPs محددة هو المسؤول في العديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية التنكسية وأمراض القلب والأوعية الدموية. كانت MMPs مركز الاهتمام مؤخرا كأهداف لتطوير العلاجات التي يمكن أن تعالج الأمراض المرتبطة بالتعبير المفرط MMP.

لدراسة آلية MMP في المحلول ، هناك حاجة إلى طرق تنقية وتنقية أكثر سهولة وقوة للتعبير عن البروتين المؤتلف لإنتاج MMPs النشطة والقابلة للذوبان. ومع ذلك ، لا يمكن التعبير عن المجال الحفاز لمعظم MMPs في الإشريكية القولونية (E. coli) في شكل قابل للذوبان بسبب نقص آلات ما بعد الترجمة ، في حين أن أنظمة التعبير عن الثدييات عادة ما تكون مكلفة ولها عوائد أقل. يجب أن تخضع هيئات تضمين MMP لعملية شاقة وشاقة للتنقية وإعادة الطي على نطاق واسع ، مما يقلل بشكل كبير من غلة MMPs في المطابقة الأصلية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا باستخدام خلايا Rosetta2(DE3)pLysS (المشار إليها فيما يلي باسم R2DP) لإنتاج المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 مصفوفة (MMP-3cd) ، والذي يحتوي على علامة N-terminal His-tag متبوعة بالمجال المؤيد (Hisx6-pro-MMP-3cd) للاستخدام في تنقية التقارب. تعزز خلايا R2DP التعبير عن البروتينات حقيقية النواة من خلال بلازميد مقاوم للكلورامفينيكول يحتوي على كودونات نادرة عادة في أنظمة التعبير البكتيري. بالمقارنة مع خط الخلية التقليدي المفضل للتعبير عن البروتين المؤتلف ، BL21 (DE3) ، فإن التنقية باستخدام هذه السلالة الجديدة حسنت إنتاجية Hisx6-pro-MMP-3cd المنقى . عند التنشيط وإزالة الملح ، يتم شق المجال الاحترافي جنبا إلى جنب مع N-terminal His-tag ، مما يوفر MMP-3cd نشطا للاستخدام الفوري في عدد لا يحصى من التطبيقات في المختبر . لا تتطلب هذه الطريقة معدات باهظة الثمن أو بروتينات اندماج معقدة وتصف الإنتاج السريع ل MMPs البشرية المؤتلفة في البكتيريا.

Introduction

تخضع معظم البروتينات حقيقية النواة المعقدة لتعديلات متقنة بعد الترجمة بعد التعبير، مما يتطلب طي البروتين بمساعدة عالية والعوامل المساعدة لتكون وظيفية1. لا يزال إنتاج كميات كبيرة من البروتين البشري القابل للذوبان في مضيف بكتيري يمثل تحديا كبيرا بسبب ارتفاع التكاليف وعدم وجود طرق قوية للتعبير والتنقية، حتى بالنسبة للتجارب المعملية الأصغر حجما2،3. عادة ما يتم التعبير عن MMPs ، endopeptidases البشرية ذات الوزن الجزيئي الكبير ، كأجسام تضمين غير قابلة للذوبان عند التعبير عنها في E. coli. غالبا ما يؤدي استخراج MMPs البشرية القابلة للذوبان إلى عملية ذوبان وإعادة طي شاقة وتستغرق وقتا طويلا4.

MMPs لها أدوار حاسمة في كل من العمليات الفسيولوجية والمسببة للأمراض. MMPs البشرية هي عائلة من 23 إندوببتيداز الزنك ، مصنفة حسب بنية وخصوصية الركيزة ، ويتم التعبير عنها بشكل تفاضلي على الرغم من المجال الحفاز المحفوظ للغاية5,6. يتم إفراز MMPs كزيموجينات غير نشطة ، يتم تنظيمها عن طريق التنشيط بعد الترجمة ومثبطاتها الداخلية ، مثبطات الأنسجة من ميتالوبروتيناز (TIMPs) 7،8،9،10. على الرغم من الاعتراف بها في البداية لدورها في دوران ECM ، إلا أن MMPs متورطة أيضا في التطوير ، والتشكل ، وإصلاح الأنسجة ، وإعادة التشكيل8. تم ربط خلل تنظيم MMPs بشكل ملحوظ بالسرطان إلى جانب الأمراض العصبية التنكسية والقلب والأوعية الدموية والتليف ، من بين أمراض أخرى5,7.

يعد تطوير طرق إنتاج MMP قوية على نطاق واسع أمرا بالغ الأهمية لضمان نجاح الدراسات المستقبلية لآليات MMP من خلال الفحوصات الكيميائية الحيوية والقائمة على الخلايا. تم التعبير عن MMPs المختلفة سابقا في البكتيريا11 ، بما في ذلك MMPs الموسومة ب Hisx6 ، دون تغيير نشاط MMP12،13،14،15. ومع ذلك ، تتضمن هذه الطرق خطوات طويلة مملة قد يكون من الصعب تكرارها.

يمكن أيضا استخدام خلايا الثدييات للتعبير عن العديد من البروتينات البشرية المختلفة مع ضمان التعديلات المناسبة بعد الترجمة16. على الرغم من أن نظام التعبير عن الثدييات هو الخيار المثالي لإنتاج البروتينات البشرية المؤتلفة مع التعديلات المناسبة بعد الترجمة، فإن العيوب الرئيسية لهذه الطريقة هي الغلة المنخفضة الأولية، ووسائط النمو والكواشف المكلفة، والجداول الزمنية الطويلة للوصول إلى خطوط التعبير المستقرة، وخطر التلوث بأنواع أخرى مثل الفطريات أو البكتيريا2،11 . علاوة على ذلك ، ينتج إنتاج MMP في خطوط خلايا الثدييات شوائب من البروتينات الخلوية المرتبطة مثل TIMPs أو fibronectins11. على عكس نمو الخلايا البطيء الذي لوحظ في خلايا الثدييات ، يوفر نظام التعبير البكتيري إنتاج البروتين على نطاق واسع في فترة قصيرة إلى جانب متطلبات أبسط للوسائط والنمو. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود بروتينات خلوية أخرى مرتبطة (أي TIMPs) في أنظمة التعبير البكتيري ، فإن MMPs النشطة بتركيزات أعلى عرضة للتدهور من خلال التحلل الذاتي ، مما يؤدي إلى ضعف إنتاجية MMP 17.

تصف هذه الورقة طريقة مفصلة للتعبير البكتيري وتنقية وتنشيط المؤتلف Hisx6-pro-MMP-3cd باستخدام E. coli كمضيف تعبير بسبب قدرته على تحمل التكاليف وبساطته ونجاحه في إنتاج غلات أعلى من MMPs2,3,18. نظرا لأن الإشريكية القولونية تفتقر إلى آلات طي البروتين والمعالجة اللاحقة للترجمة اللازمة ل MMPs المؤتلف والبروتينات المعقدة الأخرى ، فقد تم تصميم العديد من سلالات E. coli للتغلب على هذه القيود ، مما يجعل E. coli مضيف أكثر ملاءمة للتعبير عن MMP-3cd البشري المؤتلف ،19،20 . على سبيل المثال ، تعزز سلالة R2DP المستخدمة في هذه الدراسة التعبير حقيقي النواة عن طريق توفير بلازميد مقاوم للكلورامفينيكول يحتوي على كودونات نادرا ما تستخدم في الإشريكية القولونية.

كما هو موضح في هذا البروتوكول ، بعد الإفراط في التعبير عن أجسام التضمين النقية نسبيا من متجه pET-3a (الشكل 1) في خلايا R2DP ، يتم استخراج بروتينات المجال الحفاز Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) وتشويهها4. تم تنقية Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 باستخدام كروماتوغرافيا علامة التقارب. عند إعادة الطي وغسيل الكلى ، تم تنشيط pro-MMP-3cd (zymogen) بواسطة خلات 4-aminophenylmercuric (APMA) ، ويستخدم تحليل SDS-PAGE لتقييم الغلة والحاجة إلى مزيد من التنقية 5,21. يصف هذا البروتوكول التعبير والتنقية والتنشيط MMP-3cd القابل للذوبان كمثال. ومع ذلك ، يمكن استخدامه أيضا كدليل للتعبير عن MMPs الأخرى والبروتياز البشري مع تعبير مماثل ، وآليات التنشيط (الشكل 2). بالنسبة للبروتينات الأخرى غير MMP-3cd ، ينصح القارئ بتحديد التراكيب والطرق العازلة المثلى للبروتين المستهدف قبل محاولة هذا البروتوكول.

Figure 1
الشكل 1: خريطة البلازميد للبلازميد pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. يتضمن ناقل pET-3a جينا مقاوما للأمبيسلين. يتم استنساخ تسلسل علامة Hisx6 الطرفية N في المتجه المستند إلى pET-3a ، بما في ذلك pro-MMP-3cd ، لإنتاج بنية pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd تحت سيطرة مروج T7 بين مواقع تقييد BamHI و NdeI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعبير البكتيري ل pro-MMP-3cd ، والتنقية ، وإعادة الطي ، والتنشيط. 1.1: تم تحويل بلازميد pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd إلى خلايا BL21 (DE3) أو R2DP. 1.2: تم تحفيز التعبير عن البروتين Pro-MMP-3cd باستخدام IPTG. 1.3: يتم استخدام التحلل الكيميائي والصوتنة لاستخراج بروتينات Hisx6-pro-MMP-3cd التي هي أساسا غير قابلة للذوبان ووجدت في هيئات التضمين. تم استخدام اليوريا لتشويه وإذابة البروتين من أجسام التضمين. 2.1. تم تنقية بروتين Hisx6-pro-MMP-3cd المشوه عن طريق تنقية كروماتوغرافيا التقارب. 3. تم إعادة طي Hisx6-pro-MMP-3cd ببطء أثناء غسيل الكلى من خلال الإزالة التدريجية لليوريا من المخزن المؤقت. 4. أخيرا ، تم تنشيط بروتين MMP-3cd المعاد طيه باستخدام APMA عن طريق إزالة مجال N-terminal pro-peptide. تتم إزالة APMA لاحقا من المحلول من خلال تحلية المياه. تتوافق الأرقام مع أقسام البروتوكول التي تصف هذه الخطوات. الاختصارات: MMP-3cd = المجال الحفاز ميتالوبروتيناز-3 مصفوفة ؛ APMA = 4-أمينوفينيل أسيتات الزئبق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. تعبير MMP استنساخ وتحويل pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd إلى خلايا R2DP هضم البلازميد pET-3a (انظر جدول المواد) مع إنزيمات تقييد NdeI و BamHI في Digest Buffer (انظر جدول المواد). في حجم تفاعل إجمالي قدره 40 ميكرولتر ، أضف 4 ميكرولتر من Digest Buffer ، و 33 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر من البلا…

Representative Results

عند تشغيل العينات على SDS-PAGE ، نظرا لأن البروتين يتم التعبير عنه في شكل أجسام تضمين غير قابلة للذوبان ، يجب أن تحتوي الكسور المحللة والصوتية على القليل من مستخلص Hisx6-pro-MMP-3cd ، حيث لم يتم بعد إعادة إذابة البروتين في اليوريا. يقارن الشكل 3 أجزاء إزالة تنقية علامته من Hisx6-pro-MMP-3cd من ?…

Discussion

لا يزال الإنتاج الواسع النطاق ل MMPs القابلة للذوبان والبشرية والمؤتلفة مهمة صعبة. يمكن لخلايا الثدييات التعبير عن MMPs الوظيفية بتكاليف عالية وأوقات انتظار طويلة ، في حين أن E. coli تنتج بسرعة كميات كبيرة من أجسام تضمين MMP التي يجب تنقيتها وإعادة طيها11,16. تزي…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم للدكتورة إيفيت راديسكي وألكسندرا هوكلا في Mayo Clinic في جاكسونفيل بولاية فلوريدا ، لتوفيرهما بلازميد pET-3a-pro-MMP-3cd كنموذج لاستنساخ جين Hisx6pro-MMP-3cd ، وتعليقاتهما ، إلى جانب الدكتور بول هارتلي من مركز نيفادا للجينوم في جامعة نيفادا ، رينو ، لتسلسل الحمض النووي. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا كاساندرا هيرجنرادر على المساعدة في جزء من التعبير عن البروتين. م.ر.-س. أود أن أشكر منحة NIH-P20 GM103650-COBRE لعلم الأعصاب التكاملي وجائزة منحة UNR R & D mICRO SEED.

Materials

0.22 µm sterile filter Sigma Aldrich SLGP033RS Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks Thermo Fisher Scientific S76106F n/a
1 L glass bottles Thermo Fisher Scientific 06-414-1D n/a
1.5 mL microfuge tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002 n/a
15 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339650 n/a
18 G, 1-in. beveled needle Amazon B07S7VBHM2 Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column Thermo Fisher Scientific 89890 Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Thermo Fisher Scientific AAA1610422 n/a
250 mL conical bottle cushions Thermo Fisher Scientific 05-538-53A Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles Thermo Fisher Scientific 05-538-53 n/a
400 mL stirred cell Sigma Aldrich UFSC40001 Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA) Sigma Aldrich A9563-5G Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe Thermo Fisher Scientific NC0829167 Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes Thermo Fisher Scientific 339650 Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube Sigma Aldrich UFC901024D Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-500 Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25 Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI NEB R3136S Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2) Thermo Fisher Scientific 600-30-23 The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders Thermo Fisher Scientific 50-189-7544 Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol Thermo Fisher Scientific 22-055-125GM Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3 n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips Thermo Fisher Scientific 68011 Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing Thermo Fisher Scientific 88243 Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer NEB B7204S Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes Thermo Fisher Scientific 21-200-257 Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific D107125G Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix NEB E2621S Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I NEB M0303S Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol Thermo Fisher Scientific A995-4 n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Fisher Scientific J15694-AE Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit Promega A9281 Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol Thermo Fisher Scientific G33-500 Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column BioRad 7321010 Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl) Thermo Fisher Scientific AAA135430B Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells NEB C2987 High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer n/a n/a 20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl) Thermo Fisher Scientific A144C-212 Used to pH buffers
Imidazole Thermo Fisher Scientific AAA1022122 Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific FERR0392 A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media n/a n/a To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates n/a n/a To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth Thermo Fisher Scientific BP1426-2 Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer n/a n/a 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme MP Biomedicals 195303 Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit Promega A1330 If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI NEB R0111S Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin Thermo Fisher Scientific PI88221 Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix NEB M0492S A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid Addgene n/a The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes VWR 25384-342 Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells Novagen 714033 BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media NEB B9020S Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1 Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate Thermo Fisher Scientific PI89905 Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer n/a n/a 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base Thermo Fisher Scientific BP152-1 Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific M1122980101 Detergent used for cell lysis
Urea Thermo Fisher Scientific AAJ75826A7 First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2) Thermo Fisher Scientific AAA162810E Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3

References

  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897 (2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568 (2015).
  3. Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370 (2012).
  4. Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981 (2011).
  5. Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445 (2010).
  6. Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
  7. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313 (2020).
  8. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  9. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
  10. Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
  11. Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K., Galea, C. A. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. , 3-16 (2017).
  12. Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
  13. Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
  14. Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
  15. Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
  16. Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041 (2012).
  17. McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
  18. Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320 (2013).
  19. Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431 (2015).
  20. Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772 (2015).
  21. Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844 (2010).
check_url/kr/63263?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Bolt, A. J., Do, L. D., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M. Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (181), e63263, doi:10.3791/63263 (2022).

View Video