Expression bactérienne et purification de la métalloprotéinase-3 à matrice humaine par chromatographie d’affinité

Summary

La purification, la dialyse et l’activation de son étiquette sont utilisées pour augmenter les rendements de l’expression des protéines solubles du domaine catalytique de la métalloprotéinase-3 à matrice active chez les bactéries. Les fractions protéiques sont analysées via des gels SDS-PAGE.

Abstract

Les métalloprotéinases matricielles (MMP) appartiennent à la famille des protéases de metzincine avec des rôles centraux dans la dégradation et le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM), ainsi que dans les interactions avec plusieurs facteurs de croissance et cytokines. La surexpression de MMP spécifiques est responsable de plusieurs maladies telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies cardiovasculaires. Les MMP ont récemment été au centre de l’attention en tant que cibles pour développer des thérapies capables de traiter les maladies corrélées à la surexpression de la MMP.

Pour étudier le mécanisme MMP en solution, des méthodes d’expression et de purification des protéines recombinantes plus faciles et plus robustes sont nécessaires pour la production de MMP actifs et solubles. Cependant, le domaine catalytique de la plupart des MMP ne peut pas être exprimé chez Escherichia coli (E. coli) sous forme soluble en raison de l’absence de mécanisme post-traductionnel, alors que les systèmes d’expression des mammifères sont généralement coûteux et ont des rendements plus faibles. Les corps d’inclusion MMP doivent subir le processus fastidieux et laborieux de purification et de repliement approfondis, réduisant considérablement le rendement des MMP en conformation native. Cet article présente un protocole utilisant des cellules Rosetta2(DE3)pLysS (ci-après dénommées R2DP) pour produire le domaine catalytique de la métalloprotéinase matricielle-3 (MMP-3cd), qui contient une étiquette His-terminalE N suivie d’un pro-domaine (Hisx6-pro-MMP-3cd) pour une utilisation dans la purification d’affinité. Les cellules R2DP améliorent l’expression des protéines eucaryotes grâce à un plasmide résistant au chloramphénicol contenant des codons normalement rares dans les systèmes d’expression bactérienne. Par rapport à la lignée cellulaire traditionnelle de choix pour l’expression des protéines recombinantes, BL21 (DE3), la purification à l’aide de cette nouvelle souche a amélioré le rendement en Hisx6-pro-MMP-3cd purifié. Lors de l’activation et du dessalement, le domaine pro est clivé avec le N-terminal His-tag, fournissant un MMP-3cd actif pour une utilisation immédiate dans d’innombrables applications in vitro . Cette méthode ne nécessite pas d’équipement coûteux ou de protéines de fusion complexes et décrit la production rapide de MMP humains recombinants chez les bactéries.

Introduction

La plupart des protéines eucaryotes complexes subissent des modifications post-traductionnelles élaborées après leur expression, nécessitant un repliement des protéines hautement assisté et des cofacteurs pour être ^{fonctionnels1}. La production de grandes quantités de protéines humaines solubles dans un hôte bactérien reste un défi important en raison des coûts élevés et du manque de méthodes d’expression et de purification robustes, même pour des expériences de laboratoire à plus petite ^échelle2,3. Les MMP, des endopeptidases humaines de grand poids moléculaire, sont généralement exprimées sous forme de corps d’inclusion insolubles lorsqu’elles sont exprimées dans E. coli. L’extraction des MMP humains solubles conduit souvent à un processus de solubilisation et de repli laborieux et ^long4.

Les MMP jouent un rôle essentiel dans les processus physiologiques et pathogènes. Les MMP humains sont une famille de 23 endopeptidases de zinc, classées par structure et spécificité du substrat, et exprimées différemment en dépit d’un domaine catalytique hautement ^conservé5,6. Les MMP sont sécrétés sous forme de zymogènes inactifs, régulés par activation post-traductionnelle et leurs inhibiteurs endogènes, inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases (TIMPs)7,8,9,10. Bien qu’initialement reconnus pour leur rôle dans le renouvellement de l’ECM, les MMP ont également été impliqués dans le développement, la morphogenèse, la réparation des tissus et le ^remodelage8. La dérégulation des MMP a été notamment liée au cancer ainsi qu’aux maladies neurodégénératives, cardiovasculaires et fibrotiques, entre autres ^maladies5,7.

Le développement de méthodes robustes de production de MMP à grande échelle est essentiel pour assurer le succès des études futures des mécanismes MMP par le biais de tests biochimiques et cellulaires. Divers MMP ont déjà été exprimés dans des ^bactéries11, y compris des MMP marqués Hisx6, sans modifier l’activité MMP12,13,14,15. Cependant, ces méthodes comprennent des étapes longues et fastidieuses qui peuvent être difficiles à reproduire.

Les cellules de mammifères peuvent également être utilisées pour exprimer de nombreuses protéines humaines différentes tout en assurant les modifications post-traductionnelles ^{appropriées16}. Bien que le système d’expression des mammifères soit un choix idéal pour produire des protéines humaines recombinantes avec des modifications post-traductionnelles appropriées, les principaux inconvénients de cette méthode sont les faibles rendements initiaux, les milieux de croissance et les réactifs coûteux, les longs délais pour atteindre des lignes d’expression stables et le risque de contamination par d’autres espèces telles que les champignons ou les ^{bactéries2,11} . De plus, la production de MMP dans les lignées cellulaires de mammifères produit des impuretés à partir de protéines cellulaires associées telles que les TIMPs ou les fibronectines11. Contrairement à la croissance cellulaire lente observée dans les cellules de mammifères, le système d’expression bactérienne offre une production de protéines à grande échelle dans un court laps de temps ainsi que des milieux plus simples et des besoins de croissance. Cependant, en raison de l’absence d’autres protéines cellulaires associées (c.-à-d. les TIMPs) dans les systèmes d’expression bactérienne, les MMP actifs à des concentrations plus élevées sont sujets à la dégradation par autoprotéolyse, ce qui entraîne un faible rendement en ^MMP17.

Cet article décrit une méthode détaillée pour l’expression bactérienne, la purification et l’activation de Hisx6-pro-MMP-3cd recombinant en utilisant E. coli comme hôte d’expression en raison de son prix abordable, de sa simplicité et de son succès dans la production de rendements plus élevés de MMP2,3,18. Étant donné qu’E. coli n’a pas la machinerie de repliement des protéines et le traitement post-traductionnel requis pour les MMP recombinants et d’autres protéines complexes, de nombreuses souches d’E. coli ont été conçues pour surmonter ces limitations, faisant d’E. coli un hôte plus approprié pour l’expression de MMP-3cd humain recombinant,19,20 . Par exemple, la souche R2DP utilisée dans cette étude améliore l’expression eucaryote en fournissant un plasmide résistant au chloramphénicol contenant des codons rarement utilisés chez E. coli.

Comme décrit dans ce protocole, après surexpression de corps d’inclusion relativement purs du vecteur pET-3a (Figure 1) dans les cellules R2DP, les protéines du domaine catalytique Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) sont extraites et dénaturées4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 a été purifié par chromatographie par étiquette d’affinité. Lors du repliement et de la dialyse, le pro-MMP-3cd (zymogène) a été activé par l’acétate de 4-aminophénylmercurique (APMA), et l’analyse SDS-PAGE est utilisée pour évaluer les rendements et la nécessité d’une purification ^{supplémentaire5,21}. Ce protocole décrit l’expression, la purification et l’activation de MMP-3cd soluble à titre d’exemple. Cependant, il peut également être utilisé comme guide pour l’expression d’autres MMP et protéases humaines ayant une expression similaire, et des mécanismes d’activation (Figure 2). Pour d’autres protéines autres que MMP-3cd, il est conseillé au lecteur de déterminer les compositions tampons optimales et les méthodes pour leur protéine cible avant d’essayer ce protocole.

Figure 1 : Carte plasmidique du plasmide pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. Le vecteur pET-3a comprend un gène de résistance à l’ampicilline. Une séquence de balises Hisx6 n-terminales est clonée dans le vecteur pET-3a, y compris pro-MMP-3cd, pour donner la construction pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd sous contrôle du promoteur T7 entre les sites de restriction BamHI et NdeI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Expression bactérienne du pro-MMP-3cd, purification, repliement et activation. 1.1 : Le plasmide pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd a été transformé en cellules BL21(DE3) ou R2DP. 1.2 : L’expression de la protéine Pro-MMP-3cd a été induite à l’aide de l’IPTG. 1.3: La lyse chimique et la sonication sont utilisées pour extraire les protéines Hisx6-pro-MMP-3cd qui sont principalement insolubles et présentes dans les corps d’inclusion. L’urée a été utilisée pour dénaturer et solubiliser les protéines des corps d’inclusion. 2.1. La protéine Hisx6-pro-MMP-3cd dénaturée a été purifiée par purification par chromatographie d’affinité. 3. L’Hisx6-pro-MMP-3cd élué a été lentement replié pendant la dialyse par élimination progressive de l’urée du tampon. 4. Enfin, la protéine MMP-3cd repliée a été activée à l’aide de l’APMA en supprimant le domaine pro-peptidique N-terminal. L’APMA est ensuite retiré de la solution par dessalement. Les numéros correspondent aux sections du protocole décrivant ces étapes. Abréviations : MMP-3cd = Matrice métalloprotéinase-3 domaine catalytique ; APMA = acétate de 4-aminophénylmercurique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Expression MMP Clonage et transformation de pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd en cellules R2DP Digérer le plasmide pET-3a (voir le tableau des matériaux) avec les enzymes de restriction NdeI et BamHI dans digest buffer (voir le tableau des matériaux). Dans un volume de réaction total de 40 μL, ajouter 4 μL de tampon de digestion, 33 μL de 100 ng/μL de plasmide et 1,5 μL de chaque enzyme de restriction et laisser la réaction se poursuivre pendant env…

Representative Results

Lors de l’exécution d’échantillons sur SDS-PAGE, parce que la protéine est exprimée sous la forme de corps d’inclusion insolubles, les fractions lysées et soniquées doivent contenir peu ou pas d’extrait Hisx6-pro-MMP-3cd, car la protéine n’a pas encore été résolubilisée dans l’urée. La figure 3 compare les fractions d’élution de purification His-tag de Hisx6-pro-MMP-3cd à partir de cellules BL21(DE3) et de cellules R2DP. Les fractions d’élution ont été regrou…

Discussion

La production à grande échelle de MMP solubles, humains et recombinants reste une tâche difficile. Les cellules de mammifères peuvent exprimer des MMP fonctionnels à des coûts élevés et de longs temps d’attente, tandis que E. coli produit rapidement de grandes quantités de corps d’inclusion MMP qui doivent être purifiés et repliés11,16. Les cellules R2DP augmentent considérablement le rendement des corps d’inclusion MMP, permettant un …

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3