Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Summary

His-Tag-Reinigung, Dialyse und Aktivierung werden eingesetzt, um die Ausbeute an löslicher, aktiver Matrix-Metalloproteinase-3-katalytischer Domänenproteinexpression in Bakterien zu erhöhen. Proteinfraktionen werden über SDS-PAGE-Gele analysiert.

Abstract

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gehören zur Familie der Metzincinproteasen mit zentralen Rollen beim Abbau und Remodeling der extrazellulären Matrix (ECM) sowie bei Wechselwirkungen mit mehreren Wachstumsfaktoren und Zytokinen. Die Überexpression spezifischer MMPs ist für verschiedene Krankheiten wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verantwortlich. MMPs standen in letzter Zeit im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit als Ziele für die Entwicklung von Therapeutika, die Krankheiten behandeln können, die mit MMP-Überexpression korrelieren.

Um den MMP-Mechanismus in Lösung zu untersuchen, sind einfachere und robustere rekombinante Proteinexpressions- und Reinigungsmethoden für die Herstellung von aktiven, löslichen MMPs erforderlich. Der katalytische Bereich der meisten MMPs kann jedoch in Escherichia coli (E. coli) aufgrund fehlender posttranslationaler Mechanismen nicht in löslicher Form exprimiert werden, während Expressionssysteme für Säugetiere in der Regel teuer sind und geringere Erträge aufweisen. MMP-Einschlussgremien müssen den langwierigen und mühsamen Prozess der umfangreichen Reinigung und Wiederfaltung durchlaufen, wodurch die Ausbeute an MMPs in der nativen Konformation erheblich reduziert wird. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das Rosetta2 (DE3) pLysS-Zellen (im Folgenden als R2DP bezeichnet) verwendet, um eine katalytische Matrix-Metalloproteinase-3-Domäne (MMP-3cd) zu erzeugen, die einen N-terminalen His-Tag gefolgt von einer Pro-Domäne (Hisx6-pro-MMP-3cd) für die Verwendung in der Affinitätsreinigung enthält. R2DP-Zellen verstärken die Expression eukaryotischer Proteine durch ein Chloramphenicol-resistentes Plasmid, das Codons enthält, die normalerweise in bakteriellen Expressionssystemen selten sind. Im Vergleich zur traditionellen Zelllinie der Wahl für die rekombinante Proteinexpression, BL21(DE3), verbesserte die Aufreinigung mit diesem neuen Stamm die Ausbeute an gereinigtem Hisx6-pro-MMP-3cd. Nach der Aktivierung und Entsalzung wird die Pro-Domäne zusammen mit dem N-terminalen His-Tag gespalten, wodurch aktives MMP-3cd für den sofortigen Einsatz in unzähligen In-vitro-Anwendungen bereitgestellt wird. Diese Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder komplexe Fusionsproteine und beschreibt die schnelle Produktion von rekombinanten menschlichen MMPs in Bakterien.

Introduction

Die meisten komplexen eukaryotischen Proteine durchlaufen nach der Expression ausgeklügelte posttranslationale Modifikationen, die eine hochunterstützte Proteinfaltung und Co-Faktoren erfordern, um funktionsfähig zu ^sein1. Die Herstellung großer Mengen löslichen menschlichen Proteins in einem bakteriellen Wirt bleibt aufgrund der hohen Kosten und des Mangels an robusten Expressions- und Reinigungsmethoden eine erhebliche Herausforderung, selbst für kleinere ^{Laborexperimente2,3}. MMPs, humane Endopeptidasen mit großem Molekulargewicht, werden normalerweise als unlösliche Einschlusskörper exprimiert, wenn sie in E. coli exprimiert werden. Die Extraktion von löslichen humanen MMPs führt oft zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Solubilisierungs- und ^{Umfaltungsprozess4.}

MMPs spielen eine entscheidende Rolle sowohl in physiologischen als auch in pathogenen Prozessen. Humane MMPs sind eine Familie von 23 Zink-Endopeptidasen, kategorisiert nach Struktur- und Substratspezifität und differentiell exprimiert trotz einer hochkonservierten katalytischen ^Domäne5,6. MMPs werden als inaktive Zymogene sezerniert, reguliert durch posttranslationale Aktivierung und ihre endogenen Inhibitoren, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs)7,8,9,10. Obwohl MMPs ursprünglich für ihre Rolle beim ECM-Umsatz anerkannt waren, waren sie auch an der Entwicklung, Morphogenese, Gewebereparatur und -umgestaltung ^beteiligt8. Die Dysregulation von MMPs wurde unter anderem mit Krebs sowie neurodegenerativen, kardiovaskulären und fibrotischen Erkrankungen in Verbindung ^gebracht5,7.

Die Entwicklung robuster MMP-Produktionsmethoden im großen Maßstab ist entscheidend, um den Erfolg zukünftiger Studien von MMP-Mechanismen durch biochemische und zellbasierte Assays sicherzustellen. Verschiedene MMPs wurden zuvor in Bakterien exprimiert11, einschließlich Hisx6-markierter MMPs, ohne die MMP-Aktivität zu ^{verändern12,13,14,15}. Diese Methoden umfassen jedoch mühsame, lange Schritte, die möglicherweise schwer zu replizieren sind.

Säugetierzellen können auch verwendet werden, um viele verschiedene menschliche Proteine zu exprimieren und gleichzeitig die richtigen posttranslationalen Modifikationen zu ^{gewährleisten16.} Obwohl das Expressionssystem für Säugetiere eine ideale Wahl ist, um rekombinante menschliche Proteine mit geeigneten posttranslationalen Modifikationen herzustellen, sind die Hauptnachteile dieser Methode anfänglich niedrige Ausbeuten, kostspielige Wachstumsmedien und Reagenzien, lange Zeiträume zum Erreichen stabiler Mimiklinien und das Risiko einer Kontamination mit anderen Spezies wie Pilzen oder ^{Bakterien2,11} . Darüber hinaus führt die MMP-Produktion in Zelllinien von Säugetieren zu Verunreinigungen aus assoziierten zellulären Proteinen wie TIMPs oder ^{Fibronektinen11.} Im Gegensatz zu dem langsamen Zellwachstum, das in Säugetierzellen beobachtet wird, bietet das bakterielle Expressionssystem eine groß angelegte Proteinproduktion in kurzer Zeit sowie einfachere Medien- und Wachstumsanforderungen. Aufgrund des Fehlens anderer assoziierter zellulärer Proteine (d. h. TIMPs) in bakteriellen Expressionssystemen unterliegen aktive MMPs in höheren Konzentrationen jedoch dem Abbau durch Autoproteolyse, was zu einer schlechten MMP-Ausbeute ^führt17.

Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode zur bakteriellen Expression, Reinigung und Aktivierung von rekombinantem Hisx6-pro-MMP-3cd unter Verwendung von E. coli als Ausdruckshost aufgrund seiner Erschwinglichkeit, Einfachheit und seines Erfolgs bei der Erzeugung höherer Ausbeuten von MMPs2,3,18. Da E. coli nicht über die Proteinfaltungsmaschinerie und die posttranslationale Verarbeitung verfügt, die für rekombinante MMPs und andere komplexe Proteine erforderlich sind, wurden viele E. coli-Stämme entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, was E. coli zu einem geeigneteren Wirt für die Expression von rekombinantem humanem MMP-3cd ^macht,19,20 . Zum Beispiel verbessert der in dieser Studie verwendete R2DP-Stamm die eukaryotische Expression, indem er ein chloramphenicolresistentes Plasmid liefert, das Codons enthält, die selten in E. coli verwendet werden.

Wie in diesem Protokoll beschrieben, werden nach Überexpression von relativ reinen Einschlusskörpern aus dem pET-3a-Vektor (Abbildung 1) in R2DP-Zellen Hisx6-pro-MMP-3-Proteine (MMP-3cd) extrahiert und denaturiert4^. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 wurde mittels Affinitäts-Tag-Chromatographie gereinigt^. Nach der Rückfaltung und Dialyse wurde das Pro-MMP-3cd (Zymogen) durch 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) aktiviert, und die SDS-PAGE-Analyse wird verwendet, um die Ausbeuten und die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung zu ^{bewerten5,21.} Dieses Protokoll beschreibt als Beispiel den Ausdruck, die Reinigung und die Aktivierung von löslichem MMP-3cd. Es kann jedoch auch als Leitfaden für die Expression anderer MMPs und menschlicher Proteasen mit ähnlicher Expression und Aktivierungsmechanismen verwendet werden (Abbildung 2). Für andere Proteine als MMP-3cd wird dem Leser empfohlen, optimale Pufferzusammensetzungen und -methoden für sein Zielprotein zu bestimmen, bevor er dieses Protokoll versucht.

Abbildung 1: Plasmidabbildung des pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmids. Der pET-3a-Vektor enthält ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Eine N-terminale Hisx6-Tag-Sequenz wird in den pET-3a-basierten Vektor, einschließlich pro-MMP-3cd, geklont, um das pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Konstrukt unter Kontrolle des T7-Promotors zwischen BamHI- und NdeI-Restriktionssites zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bakterielle Expression von Pro-MMP-3cd, Reinigung, Rückfaltung und Aktivierung . 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmid wurde in BL21(DE3)- oder R2DP-Zellen umgewandelt. 1.2: Die Pro-MMP-3cd-Proteinexpression wurde mittels IPTG induziert. 1.3: Chemische Lyse und Beschallung werden verwendet, um Hisx6-pro-MMP-3cd-Proteine zu extrahieren, die hauptsächlich unlöslich sind und in den Einschlusskörpern vorkommen. Harnstoff wurde verwendet, um Protein aus Einschlusskörpern zu denaturieren und zu lösen. 2.1. Das denaturierte Hisx6-pro-MMP-3cd-Protein wurde durch affinitätschromatographische Reinigung gereinigt. 3. Die eluierte Hisx6-pro-MMP-3cd wurde während der Dialyse durch allmähliche Entfernung von Harnstoff aus dem Puffer langsam wieder gefaltet. 4. Schließlich wurde das gefaltete MMP-3cd-Protein mit APMA aktiviert, indem die N-terminale Pro-Peptid-Domäne entfernt wurde. APMA wird später durch Entsalzen aus der Lösung entfernt. Die Zahlen entsprechen den Protokollabschnitten, die diese Schritte beschreiben. Abkürzungen: MMP-3cd = Matrix-Metalloproteinase-3-katalytische Domäne; APMA = 4-Aminophenylquecksilberacetat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. MMP-Ausdruck Klonen und Transformation von pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd in R2DP-Zellen Fermentieren Sie das pET-3a-Plasmid (siehe Materialtabelle) mit NdeI- und BamHI-Restriktionsenzymen im Digest-Puffer (siehe Materialtabelle). Bei einem Gesamtreaktionsvolumen von 40 μL werden 4 μL Digest-Puffer, 33 μL 100 ng/μL Plasmid und 1,5 μL jedes Restriktionsenzyms zugegeben und die Reaktion ~2 h bis zum Abschluss bei 37 °C fortgesetzt. Führen S…

Representative Results

Wenn Proben auf SDS-PAGE ausgeführt werden, da das Protein in Form von unlöslichen Einschlusskörpern exprimiert wird, sollten die lysierten und beschallten Fraktionen wenig bis gar keinen Hisx6-pro-MMP-3cd-Extrakt enthalten, da das Protein noch nicht in Harnstoff resobilisiert wurde. Abbildung 3 vergleicht die His-tag-Reinigungselutionsfraktionen von Hisx6-pro-MMP-3cd aus BL21(DE3)-Zellen und R2DP-Zellen. Elution-Fraktionen wurden vor der Dialyse sowohl für BL21(DE3)- als auch für R2DP-…

Discussion

Die großtechnische Produktion von löslichen, humanen, rekombinanten MMPs bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe. Säugetierzellen können funktionelle MMPs mit hohen Kosten und langen Wartezeiten exprimieren, während E. coli schnell hohe Mengen an MMP-Einschlusskörpern produzieren, die gereinigt und wieder gefaltet werden ^{müssen11,16.} R2DP-Zellen erhöhen die Ausbeute von MMP-Einschlusskörpern signifikant und ermöglichen einen kostengünstigeren und p…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3