Bakteriell uttrykk og rensing av human matrise Metalloproteinase-3 ved hjelp av affinitet kromatografi

Summary

Hans-tag rensing, dialyse og aktivering brukes til å øke utbyttet av løselig, aktiv matrise metalloproteinase-3 katalytisk domene protein uttrykk i bakterier. Proteinfraksjoner analyseres via SDS-PAGE geler.

Abstract

Matrix metalloproteinaser (MLP)-er tilhører familien av metzincinproteaser med sentrale roller i ekstracellulær matrise (ECM) nedbrytning og ombygging, samt interaksjoner med flere vekstfaktorer og cytokiner. Overekspressering av spesifikke MMP-er er ansvarlig i flere sykdommer som kreft, nevrodegenerative sykdommer og kardiovaskulær sykdom. MMP-er har vært sentrum for oppmerksomheten den siste tiden som mål om å utvikle terapeutiske behandlinger som kan behandle sykdommer som er korrelert med MMP-overekspression.

For å studere MMP-mekanismen i løsning, er det nødvendig med mer facile og robuste rekombinante proteinuttrykk og rensemetoder for produksjon av aktive, oppløselige MMP-er. Det katalytiske domenet til de fleste MMP-er kan imidlertid ikke uttrykkes i Escherichia coli (E. coli) i løselig form på grunn av mangel på posttranslasjonsmaskineri, mens pattedyruttrykkssystemer vanligvis er kostbare og har lavere utbytter. MMP-inkluderingsorganer må gjennomgå den kjedelige og arbeidskrevende prosessen med omfattende rensing og omfolding, noe som reduserer utbyttet av MMP-er betydelig i innfødt konformasjon. Dette dokumentet presenterer en protokoll ved hjelp av Rosetta2(DE3)pLysS (heretter referert til som R2DP) celler for å produsere matrise metalloproteinase-3 katalytisk domene (MMP-3cd), som inneholder en N-terminal His-tag etterfulgt av pro-domene (Hisx6-pro-MMP-3cd) for bruk i affinitetsrensing. R2DP-celler forbedrer uttrykket av eukaryote proteiner gjennom en kloramfenikolresistent plasmid som inneholder codons som normalt er sjeldne i bakterielle uttrykkssystemer. Sammenlignet med den tradisjonelle cellelinjen for rekombinant proteinuttrykk, BL21 (DE3), forbedret rensing ved hjelp av denne nye stammen utbyttet av renset Hisx6-pro-MMP-3cd. Ved aktivering og avsalting er pro-domenet spaltet sammen med N-terminalen His-tag, og gir aktiv MMP-3cd for umiddelbar bruk i utallige in vitro-applikasjoner . Denne metoden krever ikke dyrt utstyr eller komplekse fusjonsproteiner og beskriver rask produksjon av rekombinante menneskelige MMP-er i bakterier.

Introduction

De fleste komplekse eukaryote proteiner gjennomgår forseggjorte posttranslasjonelle modifikasjoner etter uttrykk, noe som krever svært assistert proteinfolding og kofaktorer for å være ^{funksjonelle1}. Å produsere store mengder løselig humant protein i en bakteriell vert er fortsatt en betydelig utfordring på grunn av høye kostnader og mangel på robuste uttrykks- og rensemetoder, selv for mindre ^{laboratorieforsøk2,3}. MLP-er, humane endopeptidaser med stor molekylvekt, uttrykkes vanligvis som uoppløselige inklusjonslegemer når de uttrykkes i E. coli. Utvinning av løselige menneskelige MMP-er fører ofte til en arbeidskrevende, tidkrevende løsnings- og omfoldingsprosess4.

MMP-er har kritiske roller i både fysiologiske og patogene prosesser. Humane MMP-er er en familie på 23 sink endopeptidaser, kategorisert etter struktur og substratspesifisitet, og differensialt uttrykt til tross for et høyt bevart katalytisk ^domene5,6. MMP-er utskilles som inaktive zymogener, regulert via posttranslasjonell aktivering og deres endogene hemmere, vevshemmere av metalloproteinaser (TIMPs) 7,8,9,10. Selv om de først ble anerkjent for sin rolle i ECM-omsetning, har MMP-er også vært involvert i utvikling, morfogenese, vevsreparasjon og ^ombygging8. Dysregulering av MMP-er har særlig vært knyttet til kreft sammen med blant annet nevrodegenerative, kardiovaskulære og fibrotiske ^sykdommer.

Utviklingen av robuste MMP-produksjonsmetoder i stor skala er avgjørende for å sikre suksess for fremtidige studier av MMP-mekanismer gjennom biokjemiske og cellebaserte analyser. Ulike MMP-er har tidligere blitt uttrykt i ^bakterier11, inkludert Hisx6-taggede MMPer, uten å endre MMP-aktivitet12,13,14,15. Imidlertid inkluderer disse metodene kjedelige, lange trinn som kan være vanskelige å gjenskape.

Pattedyrceller kan også brukes til å uttrykke mange forskjellige menneskelige proteiner samtidig som de sikrer riktige posttranslasjonelle ^{modifikasjoner16}. Selv om pattedyruttrykkssystemet er et ideelt valg for å produsere rekombinante menneskelige proteiner med riktige postoversettelsesendringer, er de viktigste ulempene ved denne metoden innledende lave utbytter, kostbare vekstmedier og reagenser, lange tidslinjer for å nå stabile uttrykkslinjer og risiko for forurensning med andre arter som sopp eller ^{bakterier2,11} . Videre gir MMP-produksjon i pattedyrcellelinjer urenheter fra tilknyttede cellulære proteiner som TIMPer eller fibronectins11. I motsetning til den langsomme celleveksten som observeres i pattedyrceller, tilbyr bakterieuttrykkssystemet storskala proteinproduksjon på kort tid sammen med enklere medier og vekstkrav. På grunn av mangel på andre assosierte cellulære proteiner (dvs. TIMPer) i bakterielle uttrykkssystemer, er aktive MMP-er ved høyere konsentrasjoner utsatt for nedbrytning gjennom autoproteolyse, noe som resulterer i dårlig MMP-utbytte17.

Dette dokumentet beskriver en detaljert metode for bakteriell uttrykk, rensing og aktivering av rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd ved hjelp av E. coli som uttrykksvert på grunn av sin overkommelige pris, enkelhet og suksess med å produsere høyere utbytter av MMPs2,3,18. Siden E. coli mangler protein folding maskiner og posttranslational behandling som kreves for rekombinante MMP og andre komplekse proteiner, mange E. coli stammer har blitt konstruert for å overvinne disse begrensningene, noe som gjør E. coli en mer egnet vert for uttrykk for rekombinant menneskelig MMP-3cd, ^19,20 . For eksempel forbedrer R2DP-stammen som brukes i denne studien eukaryotisk uttrykk ved å levere en kloramfenikolresistent plasmid som inneholder codons som sjelden brukes i E. coli.

Som beskrevet i denne protokollen, etter overekspressering av relativt rene inklusjonslegemer fra pET-3a-vektoren (figur 1) i R2DP-celler, blir Hisx6-pro-MMP-3 katalytiske domene (MMP-3cd) proteiner ekstrahert og denaturert4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 ble renset ved hjelp av affinitetsmerkekromatografi. Ved omfolding og dialyse ble pro-MMP-3cd (zymogen) aktivert av 4-aminofenylmercuric acetat (APMA), og SDS-PAGE analyse brukes til å evaluere utbytter og behovet for ytterligere rensing5,21. Denne protokollen beskriver uttrykk, rensing og aktivering av løselig MMP-3cd som et eksempel. Det kan imidlertid også brukes som en veiledning for uttrykk for andre MMP-er og menneskelige proteaser med lignende uttrykk, og aktiveringsmekanismer (figur 2). For andre proteiner enn MMP-3cd anbefales leseren å bestemme optimale buffersammensetninger og metoder for deres målprotein før du prøver denne protokollen.

Figur 1: Plasmidkart over pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. PET-3a-vektoren inneholder et ampicillinresistensgen. En N-terminal Hisx6-tag-sekvens klones inn i den pET-3a-baserte vektoren, inkludert pro-MMP-3cd, for å gi pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-konstruksjonen under kontroll av T7-promotoren mellom BamHI og NdeI-begrensningssteder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Bakteriell uttrykk for pro-MMP-3cd, rensing, bretting og aktivering. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid ble forvandlet til BL21(DE3) eller R2DP Cells. 1.2: Pro-MMP-3cd proteinuttrykk ble indusert ved hjelp av IPTG. 1.3: Kjemisk lysis og sonikering brukes til å trekke ut Hisx6-pro-MMP-3cd proteiner som hovedsakelig er uoppløselige og finnes i inklusjonslegemene. Urea ble brukt til å denaturere og løse protein fra inklusjonslegemer. 2.1. Denaturert Hisx6-pro-MMP-3cd protein ble renset via affinitet kromatografi rensing. 3. Den eluted Hisx6-pro-MMP-3cd ble sakte omdelt under dialyse gjennom gradvis fjerning av urea fra bufferen. 4. Til slutt ble refoldet MMP-3cd protein aktivert ved hjelp av APMA ved å fjerne N-terminal pro-peptiddomenet. APMA fjernes senere fra løsningen gjennom avsalting. Tallene tilsvarer protokolldelene som beskriver disse trinnene. Forkortelser: MMP-3cd = Matrix metalloproteinase-3 katalytisk domene; APMA = 4-aminofenylmercuric acetat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. MMP-uttrykk Kloning og transformasjon av pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd til R2DP-celler Fordøye pET-3a plasmid (se materialtabellen) med NdeI- og BamHI-begrensningsenzymer i fordøyelsesbufferen (se materialtabellen). I et totalt reaksjonsvolum på 40 μL, tilsett 4 μL fordøyelsesbuffer, 33 μL 100 ng/μL plasmid og 1,5 μL av hvert begrensningsenzym og la reaksjonen fortsette i ~ 2 timer til ferdigstillelse ved 37 °C. Utfør en PCR-reaksjon…

Representative Results

Når du kjører prøver på SDS-PAGE, fordi proteinet uttrykkes i form av uoppløselige inklusjonslegemer, bør de lysede og sonikerte fraksjonene inneholde lite eller ingen Hisx6-pro-MMP-3cd ekstrakt, da proteinet ennå ikke er resolubilisert i urea. Figur 3 sammenligner His-tag-renselsesfraksjonene til Hisx6-pro-MMP-3cd fra BL21(DE3)-celler og R2DP-celler. Elution brøker ble samlet separat for både BL21 (DE3) og R2DP celler før dialyse. Fraksjoner fra hvert trinn ble kjørt etter at pro…

Discussion

Den store produksjonen av løselige, menneskelige, rekombinante MMP-er er fortsatt en utfordrende oppgave. Pattedyrceller kan uttrykke funksjonelle MPS til høye kostnader og lange ventetider, mens E. coli raskt produserer høye mengder MMP-inkluderingsorganer som må renses og brettes på ^nytt11,16. R2DP-celler øker utbyttet av MMP-inkluderingsorganer betydelig, noe som muliggjør en mer kostnadseffektiv og produktiv MMP-omfoldingsprosess. Imidlertid m…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3