Summary
В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.
Abstract
У эукариот мейоз необходим для стабильности генома и генетического разнообразия при половом размножении. Экспериментальный анализ сперматоцитов яичек имеет решающее значение для изучения сборки веретена и сегрегации хромосом при мейотическом делении самцов. Сперматоцит мыши является идеальной моделью для механистических исследований мейоза, однако эффективные методы анализа сперматоцитов отсутствуют. В данной статье сообщается о практическом и эффективном методе ингибирования in vivo кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах мышей. Представлена подробная процедура инъекции специфического ингибитора в яички GSK923295 с помощью абдоминальной хирургии у 3-недельных мышей. Кроме того, здесь описан ряд протоколов для сбора и фиксации тканей, окрашивания гематоксилин-эозином, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии. Здесь мы представляем модель торможения in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек, которая может стать мощным методом изучения мужского мейоза. Мы также демонстрируем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и остановке метафазы в первичных сперматоцитах во время мейоза I. Наш метод ингибирования in vivo облегчит механистические исследования мейоза, послужит полезным методом для генетических модификаций мужских половых линий и прольет свет на будущие клинические применения.
Introduction
Мейоз является одним из наиболее важных, очень жестких, эволюционно консервативных событий у эукариотических организмов и необходим для гаметогенеза, полового размножения, целостности генома и генетического разнообразия 1,2,3. У млекопитающих половые клетки подвергаются двум последовательным клеточным делениям, мейозу I и II, после одного раунда репликации ДНК. В отличие от сестринских хроматид при митозе, дублированные гомологичные хромосомы объединяются в пары и разделяются на две дочерние клетки во время мейоза I 4,5. При мейозе II сестринские хроматиды разрываются и разделяются, образуя гаплоидные гаметы без репликации ДНК6. Ошибки в любом из двух мейотических делений, включая дефекты сборки веретена и миссегрегацию хромосом, могут привести к потере гамет, синдромам бесплодия или анеуплоидии 7,8,9.
Накопленные исследования показали, что моторы семейства кинезинов играют решающую роль в регуляции выравнивания и сегрегации хромосом, сборки веретена, цитокинеза и прогрессирования клеточного цикла как в митотических клетках, так и в мейотических клетках10,11,12. Кинезин-7 CENP-E (центральномерный белок E) представляет собой кинетохорный двигатель, направленный на плюс-конец, необходимый для рассеивания хромосом, транспорта и выравнивания хромосом, а также для регуляции контрольной точки сборки шпинделя при митозе 13,14,15,16,17,18. Во время мейоза ингибирование CENP-E специфическим ингибитором GSK923295 приводит к остановке клеточного цикла, смещению хромосом, дезорганизации веретена и нестабильности генома в сперматогенных клетках19. Закономерности локализации и динамика CENP-E в центромерах делящихся сперматоцитов указывают на то, что CENP-E взаимодействует с белками кинетохоров для последовательной сборки центромер во время мейоза I20,21. В ооцитах CENP-E необходим для выравнивания хромосом и завершения мейоза I13,22,23. Инъекция антител или морфолино CENP-E приводит к смещению хромосом, аномальной ориентации кинетохора и остановке мейоза I как у мыши, так и у ооцитов дрозофилы 23. По сравнению с существенной ролью CENP-E в митозе, функции и механизмы CENP-E в мейозе остаются в значительной степени неизвестными. Детальные механизмы CENP-E в хромосомном конгрессе и стабильности генома в мужских мейотических клетках еще предстоит выяснить.
Сперматогенез представляет собой сложный и длительный физиологический процесс, включающий последовательную пролиферацию сперматогонии, мейоз и спермиогенез. Поэтому весь этот процесс чрезвычайно трудно воспроизвести in vitro у млекопитающих и других видов24,25. Индуцировать дифференцировку сперматоцитов после пахитеновой стадии in vitro невозможно. Исследования мужских мейотических делений, как правило, ограничивались экспериментальным анализом ранней мейотической профазы25,26. Несмотря на многие технологические усилия, в том числе кратковременное культивирование сперматоцитов27,28 и методы культивирования органов25, существует мало эффективных методов изучения мужского мейотического деления. Кроме того, генетическая делеция основных генов обычно приводит к остановке развития и эмбриональной летальности. Например, эмбрионы мышей, лишенные CENP-E, не имплантируются и не могут развиваться после имплантации29, что является препятствием для механистических исследований CENP-E в мейозе. Взятые вместе, создание практической и осуществимой системы для изучения мужского мейотического деления может значительно продвинуть область исследований мейоза.
Мелкоклеточный проницаемый ингибитор является мощным инструментом для изучения кинезиновых моторов в процессах деления и развития клеток. Аллостерический ингибитор GSK923295 специфически связывается с моторным доменом CENP-E, блокирует высвобождение АДФ (аденозиндифосфата) и, наконец, стабилизирует взаимодействие между CENP-E и микротрубочками30. В этом исследовании модель мыши с ингибированием in vivo представлена с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295. Ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в метафазе I первичных сперматоцитов. Кроме того, ингибирование CENP-E приводит к мейотической остановке сперматоцитов и нарушению сперматогенеза. Описан ряд протоколов для анализа сперматоцитов, которые могут быть применены для наблюдения микротрубочек мейотического веретена, гомологичных хромосом и субклеточных органелл в сперматоцитах. Наш метод ингибирования in vivo является эффективным методом для изучения мейотического деления и сперматогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском университете Фуцзянь (номер протокола SYXK 2016-0007). Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами Ухода и использования лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (публикации NIH No 8023, пересмотренные в 1978 году).
1. Построение GSK923295-опосредованных моделей мышей с ингибированием CENP-E
- Стерилизуйте хирургические инструменты при температуре 121 °C в течение 30 минут. Облучайте хирургический ультрачистый верстак ультрафиолетом-C (UVC) в течение 2 ч. Взвесьте 3-недельных мышей-самцов ICR (Институт исследований рака), используемых для экспериментов, и рассчитайте необходимые дозы анестетика.
- Анестезируют мышей, вводя комбинацию кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) посредством внутрибрюшинной инъекции. Проверьте глубину анестезии мышей с помощью комбинации мышиного рефлекса роговицы, ноцицептивного рефлекса, дыхания, а также мышечного тонуса. Убедитесь, что мыши находятся под глубоким наркозом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное на грелку, чтобы обеспечить тепловую поддержку во время операции. - Свяжите конечности мыши и закрепите их на восковом лотке. Нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Сбрейте волосы на животе мыши от нижней части живота до мошонки с помощью экспериментальной бритвы животного. Закрепите операционную область стерильной простыней.
- Продезинфицируйте брюшную полость живота скрабом бетадина, а затем трижды нанесите 75% этанола. Вскройте брюшную полость с помощью стерильного скальпеля и сделайте отверстие <5 мм.
- Зажмите кожу стерильными хирургическими зажимами и потяните жировую подушечку придатка яичка стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички с помощью стерильного пинцета. Зафиксируйте яичко стерильными щипцами под стереоскопом и медленно введите 10 мкл GSK923295 в семенные канальцы в конечной концентрации 10 мкМ, используя 10 мкл реодина30. Для построения контрольной группы вводят 10 мкл 1% раствора ДМСО (диметилсульфоксида)/PBS (фосфатный буферный физиологический раствор).
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните GSK923295 раствор в концентрации 10 мМ при -80 °C. Растворите 0,1 мкл 10 мМ GSK923295 в 100 мкл раствора PBS для приготовления 10 мкМ раствора GSK923295. - Аккуратно протолкните яичко обратно в брюшную полость стерильными хирургическими щипцами. Сшивают брюшину и кожу отдельно двумя-четырьмя швами, используя линию шва диаметром 0,1 мм.
- Пометьте место размером 3 x 3 мм на спине животного перманентным маркером после операции на брюшной полости, поместите мышь обратно в клетку для кормления и обеспечьте чистую среду, свободную от патогенов, с достаточным количеством пищи и воды.
- Поддерживайте окружающую среду в стерильном состоянии с помощью отфильтрованного воздуха, стерилизованных продуктов питания и воды. Ухаживайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Для послеоперационной анальгезии вводят дозу бупренорфина (0,1 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение 3 дней. Следите за тем, чтобы мышь не возвращалась в компанию других животных до полного выздоровления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам оказывают послеоперационный уход и соответствующим образом вводят в рану местную анестезию с использованием 0,5% лидокаина, чтобы уменьшить послеоперационную боль, когда это необходимо.
2. Окрашивание гематоксилин-эозином (ГЭ) и гистопатология
- Через четыре дня после операции на брюшной полости усыпьте мышей CO 2 со скоростью потока 2 л / мин в камере CO2. Подтвердите смерть от вывиха шейки матки в качестве подтверждающего метода эвтаназии. С помощью хирургических ножниц вскройте мошонку и удалите яички щипцами. Собирают семенники мыши через 4 дня после GSK923295 инъекции и фиксируют их в 30 мл 10% раствора формальдегида при комнатной температуре в течение 12 ч.
- Для градиентной дегидратации последовательно инкубируют пробу в 40 мл 70% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 85% этанола в течение 1 ч, в 40 мл 95% этанола в течение 1 ч и в 40 мл 100% этанола в течение 1 ч.
- Инкубируют образец в 40 мл ксилола в течение 40 мин, а затем в 40 мл парафина в течение 1 ч при 65 °C. Поместите салфетки на дно встраиваемой коробки. Добавьте расплавленный парафин в коробку для встраивания. Охладите салфетки до полного застывания при 4 °C в течение 6 часов.
- Закрепите образцы на держателе ультрамикротома, держите угол между образцами и поверхностью ножа 5-10° и отрегулируйте толщину среза до 5 мкм. Подготовьте срезы толщиной 5 мкм с помощью ультрамикротома, распределите предметные стекла на водяной бане при 40 ° C и высушите срезы в сушилке для горок в течение 12 часов при 37 ° C.
- Инкубировать предметные стекла в 200 мл ксилола в течение 40 мин, в 200 мл 100% этанола в течение 6 мин, в 200 мл 95% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 90% этанола в течение 2 мин, в 200 мл 80% этанола в течение 2 мин и в 200 мл 70% этанола в течение 2 мин, соответственно.
- Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 мин и окрашивайте их раствором гематоксилина Майера в течение 6 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор гематоксилина Майера: 0,011 моль/л гематоксилина, 6,7% безводного этанола, 0,646 моль/л сульфата калия алюминия и 0,003 моль/л йодата натрия. - Промойте предметные стекла в проточной воде в течение 5 мин и инкубируйте с дистиллированной водой в течение 2 мин.
- Инкубируют предметные стекла в 1% этанолом гидрохлориде в течение 3 с, а затем промывают их в проточной воде в течение 2 мин.
- Окрашивают образцы 1% эозином в течение 15 с, а затем инкубируют их с 95% этанолом в течение 5 с, со 100% этанолом в течение 2 мин и в ксилоле в течение 40 мин.
- Запечатайте предметные стекла с помощью 15 мкл нейтральной жевательной резинки и покровного стекла размером 24 x 50 мм.
3. Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия
- Соберите парафиновые срезы яичек мыши толщиной 5 мкм для иммунофлуоресценции. Инкубируют предметные стекла в ксилоле в течение 40 мин, в 100% этаноле в течение 6 мин, в 95% этаноле в течение 2 мин, в 90% этаноле в течение 2 мин, в 80% этаноле в течение 2 мин и в 70% этаноле в течение 2 мин. Промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 минут и промойте предметные стекла 0,01 М PBS в течение 5 минут.
- Поместите предметные стекла в раствор для извлечения антигена (0,01 М цитратный буфер) и кипятите под высоким давлением в скороварке в течение 4 мин для извлечения антигена. Охладите предметные стекла естественным путем до комнатной температуры. Смойте дистиллированной водой в течение 5 минут дважды, а PBS - в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,01 М цитратный буфер (рН 6,0): 2,1 ммоль / л лимонной кислоты, 11,6 ммоль / л дигидрата цитрата тринатрия. - Проникают в клетки путем инкубации предметных стекол в 500 мкл 0,25% TritonX-100/PBS в течение 10 мин. Промойте предметные стекла PBS в течение 5 минут три раза.
- Для блокирования антигена инкубируют образцы с 300 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 в PBS) в течение 1 часа. Инкубируют образцы с первичными антителами в 3% BSA/PBST в течение 16 ч при 4 °C. Положите предметные стекла в увлажненную коробку, чтобы предотвратить высыхание тканей. Разогрейте горки естественным путем до комнатной температуры в течение 30 минут.
- Выбросьте первичные антитела, а затем промойте предметные стекла в PBST в течение 5 мин три раза. Разбавляют вторичные антитела в 3% BSA/PBST. Инкубируют образцы со вторичными антителами в течение 1-2 ч при 37 °C. Промойте образцы в PBST в течение 5 минут пять раз.
- Окрашивают ядра 50 мкл 4', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин при комнатной температуре. Установите покровное стекло с помощью монтажного носителя с защитой от выцветания и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей.
- Наблюдайте и записывайте флуоресцентные сигналы на предметных стеклах с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом NA 40x/0,75.
4. Проточная цитометрия
- Соберите семенники мыши в чашки Петри диаметром 6 см и разрежьте семенники на1 мм 3 части с помощью хирургических ножниц.
- Переваривают яички, используя 1 мл 1% коллагеназы в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл в течение 10 мин при 37 ° C, а затем центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, чтобы осаждать сперматогенные клетки.
- Выбросьте надосадочную жидкость, а затем добавьте 1 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в течение 20 мин при 37 ° C, а затем центрифугируйте образцы при 1,000 x g в течение 5 мин.
- Выбросьте надосадочную жидкость, а затем инкубируйте осажденные клетки с 1 мл 70% холодного этанола в течение более 8 ч при 4 ° C.
- Центрифугируют образцы при 1000 x g в течение 5 мин, а затем собирают клеточные осадки. Окрашивают сперматогенные клетки окрашивающим раствором 500 мкл йодида пропидия (PI) (50 мкг/мл PI, 100 мкг/мл РНКазы A и 0,2% Triton X-100 в PBS) при 37 °C в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхивайте центрифужную пробирку каждые 5 минут, чтобы избежать скопления клеток. - Отфильтруйте образцы с помощью сетки 300 меш, чтобы избавиться от клеточного мусора; соберите клетки в проточную трубку и храните их при температуре 4 °C.
- Обнаружение сигналов флуоресценции и рассеяния света на длине волны возбуждения 488 нм с помощью проточного цитометра. Проанализируйте содержание ДНК и рассеяние света с помощью программного обеспечения Modfit MFLT32.
5. Просвечивающая электронная микроскопия
- Разрежьте семенники на 1 мм 3 части с помощью острого скальпеля и быстро инкубируйте образцы с3 % глутаровым альдегидом и 1,5% раствором параформальдегида в 0,1 М PBS (pH 7,2) в течение 4 ч при 4 °C, чтобы избежать изменений ультраструктуры. Промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 минут три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель и ножницы должны быть острыми, и старайтесь избегать искусственного сдавливания и вытягивания. Обработку образцов следует проводить в фиксирующей жидкости. - Зафиксируйте образцы в 1% растворе осмической кислоты-1,5% ферроцианида калия при 4 °С в течение 1,5 ч. Вытрите воду фильтровальной бумагой и промойте образцы 0,1 М PBS в течение 5 мин три раза.
- Обезвоживают образцы в 40 мл 50% этанола в течение 10 мин при 4 °C. Инкубируют образцы в 40 мл 70% этанола, насыщенного ацетатным красителем урана, при 4 °C в течение 12 ч, в 40 мл 90% этанола в течение 10 мин при 4 °C, в 40 мл 90% этанола-ацетона в течение 10 мин при комнатной температуре и в 40 мл безводного ацетона в течение 10 мин три раза при комнатной температуре.
- Инкубируют образцы в безводной смеси закладочных агентов ацетон-эпоксидной смолы 618 (v/v=1:1) в течение 1,5 ч, а затем заделывают образцы в добавочные агенты эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 3 ч.
- Для полимеризации смолы образцы инкубируют в добавочных агентах эпоксидной смолы 618 при 35 °C в течение 12 часов, при 45 °C в течение 12 часов, а затем при 60 °C в течение 24 часов.
- Установите образцы и стеклянный нож, а затем отрегулируйте расстояния между образцами и ножом. Подготовьте ультратонкие срезы толщиной 90 нм с помощью ультратонкого микротома. Нарежьте образцы с постоянной скоростью, а затем поместите предметные стекла на никелевую сетку. Поместите предметные стекла в чашку Петри комнатной температуры.
- Окрашивают предметные стекла 2% уранилацетатом в течение 10 мин, а затем окрашивают образцы 2% цитратом свинца в течение 10 мин. Промойте предметные стекла дистиллированной водой. Сушите предметные стекла в течение 24 ч при комнатной температуре.
- Наблюдайте за предметными стеклами и записывайте электронные изображения при напряжении 70-100 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно построили in vivo модель ингибирования CENP-E яичек мыши с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK92329519. Основные технические этапы этого метода были показаны на рисунке 1. После инъекции яичек GSK923295 в течение 4 дней яички были собраны для дальнейшего анализа. В контрольной группе сперматогенная волна в семенных канальцах была регулярной и организованной (рис. 2А). Однако в GSK923295 группе сперматогенная волна была изменена в семенных канальцах, а метафаза задержанных первичных сперматоцитов была значительно увеличена после ингибирования CENP-E (рис. 2B-D). Важно отметить, что несколько гомологичных хромосом не были выровнены на экваториальной пластине после ингибирования CENP-E (рис. 2B-D). Кроме того, ингибирование CENP-E также привело к увеличению метафазных сперматоцитов I в семенных канальцах (рис. 2E, F, G). Взятые вместе, ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом в первичных сперматоцитах во время мейоза I, что говорит о том, что CENP-E отвечает за конгресс хромосом и выравнивание сперматоцитов в мейозе.
Для дальнейшей проверки этих результатов мы провели иммунофлуоресцентные анализы для обнаружения сперматогенных клеток в семенных канальцах. Мы обнаружили, что регулярная сперматогенная волна, показанная в контрольной группе, была явно изменена и стала нерегулярной в GSK923295 группе (рис. 3). Мейотическое веретено делящихся сперматоцитов было помечено антителом против α-тубулина, а поперечная нить синаптонемных комплексов в сперматоцитах была помечена антителом к антисинаптонемному комплексу белка 3 (SYCP3) (рис. 3А). Количество SYCP3-положительных клеток на семенных канальцах уменьшилось после ингибирования CENP-E (рис. 3B). Между тем, точки SYCP3 на метафазную ячейку не были нарушены после ингибирования CENP-E (рис. 3C). Кроме того, растяжки SYCP3 на клетку также не были затронуты в GSK92395 группах (рис. 3D). Поразительно, но мы обнаружили, что расстояния между полюсами веретена в метафазных сперматоцитах I были увеличены после ингибирования CENP-E (рис. 3E, F). Эти иммунофлуоресцентные результаты свидетельствуют о том, что CENP-E необходим для смещения хромосом и процессов сперматогенеза, а также необходим для поддержания биполярного веретена и организации мейотического веретена.
Чтобы исследовать клеточные популяции в яичках мышей, мы переварили яички и провели окрашивание PI и анализы проточной цитометрии (рис. 4). Важные технические процедуры были показаны на рисунке 4A-C. Сперматогенные клетки состоят из нескольких клеточных популяций, включая сперматогонии, первичные сперматоциты, вторичные сперматоциты, сперматиды и сперматозоиды. Содержание ДНК этих сперматогенных клеток показано на рисунке 4А. Мы продемонстрировали, что ингибирование CENP-E привело к уменьшению гаплоидных клеток с 42,95 ± 1,09% в контрольной группе до 38,26 ± 1,86% в группе GSK923295 (рис. 4B-D). Соотношения диплоидных клеток и клеток анеуплоидии не подвергались значительному влиянию после ингибирования CENP-E (рис. 4E, F). Кроме того, соотношение тетраплоидных клеток увеличивается с 17,76 ± 1,52% в контрольной группе до 28,88 ± 2,05% в GSK923295 группе (рис. 4G). Взятые вместе, мы обнаруживаем, что клеточные популяции сперматогенных клеток немного изменяются после ингибирования CENP-E. Ингибирование CENP-E приводит к уменьшению гаплоидных клеток и увеличению тетраплоидных клеток, что указывает на то, что ингибирование CENP-E связано с остановкой метафазы в делящихся сперматоцитах.
Кроме того, мы наблюдали субмикроскопическую структуру сперматогенных клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 5). Организация хроматина, эндоплазматический ретикулум и митохондрии сперматоцитов показаны на рисунке 5. Мы обнаружили, что организация сперматогенных клеток была незначительно нарушена в GSK923295 группе (рис. 5).
Рисунок 1: Создание модели ингибирования яичек мыши in vivo с помощью абдоминальной хирургии и введения яичек. (A) Все хирургические инструменты, используемые в абдоминальной хирургии. 1) рассекающие ножницы, 2) игольчатые щипцы, 3) прямые щипцы, 4) пинцетт, 5) реодин, 6) шприц объемом 1 мл, 7) скальпель с ручкой No 3 и лезвием No 11, 8) стилолит, 9) иглы для круглого сшивания, 1/2 0,6 х 14 мм, 1/2 0,7 х 17 мм, 10) тампоны этанола. (Б) После анестезии мышей помещали в положение лежа на спине на восковом лотке, подготавливали нижнюю часть живота и дезинфицировали 75% этанолом. (C) Отверстие диаметром <5 мм было сделано в середине нижней части живота. (D) Жировую подушку придатка яичка вытягивали стерильными рассекающими щипцами, чтобы найти яички. В яичко вводили 10 мкл GSK923295 с использованием реодина объемом 10 мкл. (E) Брюшина и кожа были одновременно зашиты двумя швами. (F) Рану дезинфицировали 75% этанолом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ингибирование CENP-E привело к остановке мейоза I и смещению хромосом в сперматоцитах мыши. (A) HE окрашивание сперматогенных клеток в контрольной группе. Стрелками обозначены сперматоциты. (B) HE окрашивание сперматогенных клеток в GSK923295 группе. В яички вводили GSK923295 в течение 4 дней в конечной концентрации 10 мкМ. Стрелки указывают на смещение хромосом в сперматоцитах. Для всех изображений масштабная линейка, 10 мкм. (C) Соотношение метафазных сперматоцитов в семенных канальцах. контроль, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. Было проанализировано N = 1308 клеток. Группа = 4. t-критерий Стьюдента. Полосы погрешностей, средние значения ± SEM. ***, P < 0,001. (D) Соотношение семенных канальцев с делящимися сперматоцитами. Контроль, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. Проанализировано N = 151 семенных канальцев. Группа = 4. (E) Иммунофлуоресцентные изображения гистона H3 (фосфо Ser 10) и TUBA4A в контрольной и GSK923295 группах. TUBA4A, красный; Гистон H3 (фосфо Ser 10), зеленый; DAPI, синий. Масштабная линейка, 10 мкм. Увеличенное поле увеличивается. (F) Количественная оценка количества метафазных клеток в семенных канальцах. контрольный, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11. (Г,Г) Линейный анализ интенсивности флуоресцентных интенсификаций гистонов H3 и TUBA4A в метафазных I сперматоцитах контрольной группы (G) и GSK923295 группы (H). TUBA4A, красный; Гистон H3 (фосфо Ser 10), зеленый; DAPI, синий. Ось X указывает относительное расстояние. Ось Y указывает на интенсивность флуоресценции. t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± SEM. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ингибирование CENP-E GSK923295 привело к дезорганизации семенных канальцев и нарушению сперматогенеза. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения SYCP3 и TUBA4A в контрольной и GSK923295 группах. SYCP3, красный; TUBA4A, зеленый; DAPI, синий. Масштабная линейка, 10 мкм. (B) SYCP3-положительные клетки на семенные канальцы в контрольной и GSK923295 группах. Контроль, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Количественная оценка точек SYCP3 на метафазные ячейки. Контрольная, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Количественные определения растяжений SYCP3 на клетку в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8.21 ± 0.21. N = 19. (E) Анализ расстояния между полюсами веретена в метафазных сперматоцитах I. Контроль, 8,20 ± 0,28 мкм; GSK923295, 9,30 ± 0,29 мкм. N = 30. (F) Иммунофлуоресцентные изображения семенных канальцев в контрольной и GSK923295 группах. Стрелками обозначены сперматоциты. DAPI, зеленый; β-тубулин, зеленый. Увеличенные изображения пунктирной рамки были показаны в увеличенном масштабе. Для всех изображений масштабная линейка, 10 мкм. t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± СЭМ. нс, P > 0,05; **, P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ сперматогенных клеток в яичках мышей . (A) Схематические иллюстрации ключевых этапов анализа клеточного цикла сперматогенных клеток мыши. Диплоидные сперматоциты подвергаются мейозу I и II с образованием гаплоидных сперматид. Значение C указывает на содержание ДНК. Значение N (плоидность) указывает на количество наборов хромосом. (В,В) Проточный цитометрический анализ сперматогенных клеток контрольной группы (В) и GSK923295 группы (С). Для ингибирования CENP-E in vivo GSK923295 вводили в яички мышей ICR 3-недельного возраста в конечной концентрации при 10 мкМ в течение 4 дней. Для анализа клеточного цикла было измерено и проанализировано n = 3000 клеток. P4, гаплоидные клетки (1С). P5, диплоидные клетки (2C). P6, тетраплоидные клетки (4C). (D) Соотношение гаплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Соотношение диплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Соотношение анеуплоидных клеток (2C ~ 4C) в контрольной и GSK923295 группах. контроль, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Соотношение тетраплоидных клеток в контрольной и GSK923295 группах. Контроль, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Для всех графиков t-критерий Стьюдента. Погрешность баров, средняя ± SEM. нс, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Электронный микроскопический анализ сперматогенных клеток в контрольной и GSK923295 группе . (A) Репрезентативные изображения семенных канальцев в контрольной группе. Масштабная линейка, 5 мкм. (B) Увеличенное изображение ядра сперматоцита. Стрелками обозначен гомологичный хроматин сперматоцитов. Масштабная линейка, 1 мкм. (C) Увеличенное изображение цитоплазмы сперматоцитов. Масштабная линейка, 1 мкм. (D) Репрезентативные изображения семенных канальцев в GSK923295 группе. Яички обрабатывали 10 мкМ GSK923295 в течение 4 дней. Масштабная линейка, 5 мкм. (E) Увеличенное изображение ядра сперматоцита в GSK923295 группе. Масштабная линейка, 1 мкм. (F) Увеличенное изображение цитоплазмы сперматоцитов в GSK923295 группе. Масштабная линейка, 1 мкм. Для всех графов, ск, сперматоцитов; SD, сперматиды. ЭР, эндоплазматический ретикулум; МТ, митохондрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы создали модель ингибирования CENP-E in vivo яичек мыши с использованием абдоминальной хирургии и микроинъекции GSK923295. Абдоминальная хирургия и метод инъекций яичек, используемые в этом исследовании, имеют следующие преимущества. Во-первых, он не ограничивается возрастом мышей. Экспериментаторы могут выполнять инъекцию яичек на ранней стадии, например, у 3-недельных или более молодых мышей. Во-вторых, GSK923295 оказывает специфическое и превосходное ингибирующее действие на CENP-E. В-третьих, этот метод прост в эксплуатации и легко воспроизводим. Кроме того, сохраняется целостность яичек, что подходит для исследований неповрежденных тканей в разрезе органов.
В этом протоколе есть несколько важных шагов. Например, важно поддерживать стерильную среду во время абдоминальной хирургии для профилактики послеоперационных инфекций31. Кроме того, для мышей разного возраста или разных экспериментальных животных количество инъекций должно быть соответствующим образом скорректировано в соответствии с размером яичек и эффективностью лекарств19,32. Кроме того, правильное время переваривания и микроскопическое наблюдение необходимы для определения отдельных клеток и последующего тестирования клеточной популяции во время проточной цитометрии. Однако в этих протоколах есть несколько ограничений. Трудно использовать абдоминальную хирургию для построения модели мыши, когда возраст мыши составляет менее 2 недель. Основные причины заключаются в том, что мыши слишком молоды, послеоперационная диета затруднена, а выживаемость низкая. Лекарственные средства, используемые на животных моделях, являются жидкими и обладают характеристиками легко проникающих клеточных мембран 19,32,33, которые подходят для применения этого метода введения.
Понимание мейоза стимулируется исследованиями клеточных культур in vitro и нокаута генов, однако его нелегко применить к сперматоцитам млекопитающих28. Препятствием для механистических исследований мужского мейоза было отсутствие соответствующей системы для манипулирования и наблюдения за делящимися сперматоцитами в мейозе27. Мышь является отличным модельным организмом в исследовании клеточных и молекулярных механизмов мейоза в процессе сперматогенеза. Первая волна сперматоцитов мышей начинает мейоз на 10-й день после родов (dpp) и развивается в зрелые сперматозоиды на 35 dpp, что обеспечивает временное окно развития для исследований мейотического деления и сперматогенеза34.
Инъекция яичек, включая прямую инъекцию через мошонку и микроинъекцию через полостную хирургию, является полезным методом для исследований сперматогенеза35,36. Прямая инъекция через мошонку является быстрой и простой и вызывает лишь незначительную хирургическую травму, которая подходит для мышей в возрасте 4 недель и старше с яичками, опускающимися к мошонке. Тем не менее, нельзя вводить неопущение яичка 3-недельным или более молодым мышам. Микроинъекция через внутрибрюшинную хирургию или хирургию мошонки подходит для инъекции неопущения яичек, что требует профессиональных хирургических навыков экспериментальных операторов, стереомикроскопа, хирургического и лабораторного оборудования. В зависимости от мест инъекций микроинъекции можно разделить на инъекции в семенные канальцы, инъекции яичковой сетки и внутритканевую инъекцию яичка. По сравнению с другими моделями яичек на основе инъекций, инъекция ингибиторов с помощью абдоминальной хирургии может эффективно ингибировать функции белков и иметь преимущества в проникновении в клеточную мембрану, простых процедурах и длительном ингибировании 19,32. Методы с использованием миРНК, антисмысловых олигонуклеотидов или лентивируса имеют большие ограничения в низкой эффективности проникновения клеточных мембран, побочных эффектов и легкой деградации миРНК или олигонуклеотидов in vivo 37,38,39,40.
Мейотическое деление в живых тканях является более сложным, чем в условиях культивирования, в которых следует принимать во внимание архитектуру ткани, передачу сигналов развития и факторы окружающей среды in vivo 41. Предыдущие исследования показали, что питательные среды и клеточные автономные факторы имеют решающее значение для стимуляции начала фазы мейотического деления. Например, ингибитор фосфатазы окадаиновая кислота (ОА)42, специфический для сперматоцитов гистон HIST1H1T43, топоизомераза II 44 и метафазный стимулирующий фактор (MPF)45 способствуют переходу G2/MI в культивируемых сперматоцитах. Эти сложные условия и факторы культивирования способствуют ограничению кратковременного культивирования сперматоцитов.
Прямая инъекция плазмидной ДНК в яички успешно применяется при опосредованном яичками переносе генов и производстве трансгенных мышей32,46. Электропорация in vivo включает инъекцию плазмиды экспрессии ДНК в просвет семенных канальцев, а затем использование серии электрических импульсов для изменения проницаемости клеточной мембраны, повышения эффективности экспрессии трансгенов и генетической модификации 45,46,47,48,49. Наш метод может быть объединен с электропорацией in vivo, а также с флуоресцентными мечеными белками и инструментами редактирования генов, что делает этот подход более мощным для анализа мужского мейотического деления в физиологическом контексте тканей и органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарим всех сотрудников лаборатории цитоскелета Медицинского университета Фуцзянь за полезные обсуждения. Мы благодарим Цзюнь-Цзинь Линя из Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в проточной цитометрии. Мы благодарим Минг-Ся Ву и Линь-Ин Чжоу из Лаборатории электронной микроскопии Центра обслуживания общественных технологий Медицинского университета Фуцзянь за техническую помощь в электронной микроскопии. Мы благодарим Си-И Чжэн, Ин Линь, Ци Кэ и Цзюнь Сун из Экспериментального учебного центра фундаментальных медицинских наук Медицинского университета Фуцзянь за их поддержку. Это исследование было поддержано следующими грантами: Национальный фонд естественных наук Китая (грант No 82001608), Фонд естественных наук провинции Фуцзянь, Китай (номер гранта 2019J05071), Проект технологий здравоохранения провинции Фуцзянь (номер гранта 2018-1-69), Фонд стартапов для научных исследований, Медицинский университет Фуцзянь (номер гранта 2017XQ1001), Проект финансирования научных исследований высокого уровня талантов Медицинского университета Фуцзянь (грант No XRCZX2017025) и Исследовательский проект онлайн-образования и преподавания аспирантов китайской медицины (грант No B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R.
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A.
- Lawrence, C. J., et al.
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
