Summary
Dit artikel schetst basismethoden om belangrijke factoren zoals dichtheid, voerbeschikbaarheid, hydratatiebron en omgevingscontroles te standaardiseren voor het langdurig kweken van laboratoriumculturen van de eetbare krekel, Gryllus bimaculatus.
Abstract
Gryllus bimaculatus (De Geer) is een grote krekel verspreid over Afrika en Zuid-Eurazië, waar het vaak in het wild wordt geoogst als menselijk voedsel. Buiten zijn oorspronkelijke verspreidingsgebied is het kweken van G. bimaculatus haalbaar vanwege de plasticiteit in de voeding, de snelle voortplantingscyclus, het ontbreken van de vereiste diapause, de tolerantie voor het fokken met hoge dichtheid en de robuustheid tegen ziekteverwekkers. G. bimaculatus kan dus een veelzijdig model zijn voor studies van insectenfysiologie, gedrag, embryologie of genetica.
Culturele parameters, zoals bezettingsdichtheid, refugia binnen de kooi, fotoperiode, temperatuur, relatieve vochtigheid en dieet, hebben allemaal invloed op de groei, het gedrag en de genexpressie van cricket en moeten worden gestandaardiseerd. In de ontluikende literatuur over het kweken van insecten voor menselijke consumptie, worden deze krekels vaak gebruikt om kandidaat-voederbijmengingen afgeleid van gewasresten, voedselverwerkende bijproducten en andere goedkope afvalstromen te evalueren.
Ter ondersteuning van lopende experimenten ter evaluatie van de groeiprestaties en voedingskwaliteit van G. bimaculatus als reactie op variabele voedersubstraten, is een uitgebreide set standaardprotocollen voor fokken, onderhoud, hantering, meting en euthanasie in het laboratorium ontwikkeld en hier gepresenteerd. Een industriestandaard krekelvoer is qua voedingswaarde adequaat en functioneel geschikt gebleken voor het langdurig onderhoud van krekelkbroedbestanden, evenals voor gebruik als experimenteel controlevoer. Het fokken van deze krekels met een dichtheid van 0,005 krekels / cm3 in met schermen bedekte polyethyleenkooien van 29,3 L bij een gemiddelde temperatuur van 27 ° C op een fotoperiode van 12 licht (L) / 12 donker (D), met bevochtigde kokosvezel die zowel als hydratatiebron als ovipositiemedium dient, heeft met succes gezonde krekels gedurende een periode van 2 jaar volgehouden. Volgens deze methoden leverden krekels in een gecontroleerd experiment een gemiddelde massa op van 0,724 g 0,190 g bij de oogst, met 89% overleving en 68,2% seksuele rijping tussen de kous (22 dagen) en de oogst (65 dagen).
Introduction
Zoals getypeerd door het iconische insect, de fruitvlieg Drosophila melanogaster, biedt het gebruik van insecten als laboratoriummodelorganismen duidelijke voordelen voor studies in genetica, toxicologie en fysiologie1. Het kleine formaat van insecten vermindert de ruimte die nodig is voor culturen en de hoeveelheid voer en verbruiksmaterialen die nodig zijn. Veel insecten planten zich snel voort, waardoor ze bij uitstek geschikt zijn voor het creëren van gespecialiseerde genetische lijnen en studies die de evaluatie van meerdere opeenvolgende generaties vereisen.
Veel studies richten zich op holometabool insecten zoals Drosophila, die volledige metamorfose en verpopping vertonen. Er zijn echter andere modellen beschikbaar, waaronder Gryllus bimaculatus (De Geer), de twee-gevlekte veldkrekel. G. bimaculatus is een paurometaboleus insect dat tussen de 7 en 11 nimfachtige instars ondergaat voordat het geslachtsrijp wordt2. Deze krekel vertoont een breed scala aan gedragingen met betrekking tot seksuele selectie, waaronder stridulatie, territoriale vertoningen en mate-guarding3. Onvolgroeide krekels zijn anders dan de larven van holometabool insectensoorten omdat ze, net als veel paurometaboleuze juvenielen, verloren en beschadigde ledematen kunnen regenereren tijdens ecdysis4. Daarnaast werd in 2021 het volledig gesequencede genoom van G. bimaculatus gepubliceerd5. Deze kenmerken maken deze krekels aantrekkelijk als doelwit voor fundamenteel onderzoek.
Twee-gevlekte veldkrekels worden op grote schaal gekweekt voor menselijk voedsel en veevoer. De schaal van deze operaties is vaak veel groter dan voor laboratoriumonderzoek 6,7. Ondanks het verschil in schaal overlappen de uitdagingen waarmee onderzoekers worden geconfronteerd sterk met die van commerciële cricketboeren. Deze overwegingen komen samen in de context van laboratoriumonderzoek gericht op het verbeteren van de productie van eetbare insecten. Naarmate de eetbare insectenindustrie blijft evolueren en groeien, is het optimaliseren van voerinputs en talloze andere aspecten van de productie een primair doel8. Laboratoriumstudies die gemeten verbeteringen in de efficiëntie van het fokken, overleven of generatietijd in deze krekels aantonen, hebben het potentieel om de winstgevendheid van cricketlandbouwactiviteiten op lange termijn te helpen verhogen.
Gestandaardiseerde opfokprotocollen maken een nauwere vergelijking mogelijk tussen studies die de optimalisatie van de opfok onderzoeken. Tot op heden zijn er weinig diepgaande protocollen voor het fokken van G. bimaculatus in het laboratorium gepubliceerd. Een ideaal protocol zou de omstandigheden weerspiegelen die worden aangetroffen in de echte cricketlandbouwactiviteiten, met behoud van de strikt gecontroleerde omstandigheden die nodig zijn om veranderingen in groeiprestaties als gevolg van experimentele behandelingen nauwkeurig te meten en risicobeperkende strategieën te benadrukken. De methoden die in dit artikel worden beschreven, zijn ontwikkeld op basis van gepubliceerde protocollen, technieken en apparaten die worden gebruikt om een verscheidenheid aan krekelsoorten te kweken op een breed scala aan laboratorium- en commerciële productieschalen 2,9,10,11,12. Deze methoden worden ook geïnformeerd door verschillende niet-peer-reviewed bronnen, waaronder ongepubliceerde technische bulletins en persoonlijke communicatie met commerciële cricketboeren in Noord-Amerika. Dit protocol is ontwikkeld met de bedoeling om de oprichting van laboratoriumculturen van G. bimaculatus te vergemakkelijken, specifiek voor gebruik in proeven met betrekking tot insectenteelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het ovipositiesubstraat
OPMERKING: Kokosvezel is een ideaal ovipositiesubstraat voor G. bimaculatus. Voor gedetailleerde methoden voor het scheiden van kokos van samengeperste kokossteen en een opmerking over ademhalingsveiligheid, zie aanvullende materialen stap 1.1.
- Was de handen met water en zeep.
- Tarra een schone container op een balans en weeg een massa droge kokosvezel ongeveer zo groot als een menselijke vuist.
- Plaats kokos in een afsluitbare, schone container, die ruimte biedt aan uitbreiding tot 6x het oorspronkelijke volume.
- Breek met schone handen voorzichtig klonten kokos uit het stuk dat uit het grotere blok is verwijderd.
- Meet met behulp van een maatcilinder van 50 ml het juiste volume gedeïoniseerd (DI) water om een massaverhouding van 5: 1 van vijf delen water tot één deel droog kokos te bereiken.
- Voeg het afgemeten DI-water langzaam toe en hydrateer alle kokosdeeltjes gelijkmatig. Macerklonters handmatig om een gelijkmatige hydratatie te garanderen.
- Tarra opnieuw de container waarin de kokos eerder werd gewogen.
- Weeg 75 g bevochtigde kokos af.
- Breng 75 g van de bevochtigde kokos over in een petrischaaltje van 100 mm x 15 mm met een schone plastic lepel om ervoor te zorgen dat de kokos gelijkmatig over de bodem van de schaal wordt verdeeld en dat er geen klonten zijn.
- Label de zijkant van de petrischaal met laboratoriumtape met een label dat de geboortekolonie en de datum van de eiverzameling aangeeft.
- Meet nog eens 45 ml DI-water in een gegradueerde cilinder.
- Voeg gelijkmatig water toe over het oppervlak van de verpakte kokos in de petrischaal om een gelijkmatige hydratatie te garanderen. Zorg ervoor dat de kokos verzadigd is tot het punt dat water ongeveer 1/4 van de zijkanten van de container ophoopt.
- Zodra de petrischaal is verpakt, sluit u de resterende bevochtigde kokos in een luchtdicht vat voor opslag bij -20 °C.
OPMERKING: Volgens de methoden die in dit artikel worden voorgeschreven, zullen G. bimaculatus-personen na gemiddeld 58 dagen na ovipositie geslachtsrijp worden. - Eieren verzamelen
- Plaats het gehydrateerde ovipositiesubstraat in kooien met de gewenste ouderlijke voorraden krekels zo ver mogelijk van het voer vanwege het potentieel voor krekels om mechanisch korrels voer over te brengen op het ovipositiesubstraat.
- Documenteer de datum en tijd.
OPMERKING: De gestandaardiseerde werkdichtheid voor reproductieve krekelkolonies die volgens deze methoden worden grootgebracht, is n = 150 volwassen individuen. Bij die dichtheid zal een 24-uurs ovipositievenster tussen de 800 en 1.500 eieren opleveren, afhankelijk van de kolonieleeftijd, eerdere ovipositie-inspanning en ouderkooi geslachtsverhouding. - Plaats een kleine autoclaveerbare afvalcontainer op het werkoppervlak om rekening te houden met het insluitingsrisico van het hanteren en reinigen van eirijke ovipositiesubstraten.
- Plaats een schone, lege plastic kooi van 29,3 liter op de bank naast de afvalcontainer om te dienen als de ontvangende kooi voor het eirijke ovipositiesubstraat.
- Plaats de kooi van 29,3 L met de oorspronkelijke krekelvoorraden en het ovipositiesubstraat aan de andere kant van de afvalcontainer van de lege kooi.
- Verwijder na 24 uur het ovipositiesubstraat uit de ouderkrekelkooi en plaats het boven het autoclaveerbare afvalvat.
- Inspecteer de bovenkant van het ovipositiesubstraat op deeltjes frass of voer die de krekels mogelijk op het oppervlak van de kokos hebben geschopt.
OPMERKING: Elke stof, die geen eimassa of kokos is, kan tijdens de incubatie schimmel op het substraat veroorzaken. - Verwijder kokosverontreinigingen in het afvalvat met een schone scoopula of plastic lepel.
- Plaats de plastic lepel in de afvalcontainer.
- Plaats het gereinigde ovipositiesubstraat in de schone kooi van 29,3 liter.
- Plaats de kooi in een incubator die is ingesteld op 27 °C bij 60% relatieve vochtigheid op een fotoperiode van 12 h D/12 h L.
- Breng de kooi met het fokbestand terug naar de oorspronkelijke locatie en verwijder alle items van het werkoppervlak.
- Plaats de afvalcontainer in een vriezer in de faciliteit die is bestemd voor de opslag van items die mogelijk besmet zijn met krekeleieren.
- Ontsmet het werkoppervlak met 10% bleekoplossing en laat het 60 s zitten.
- Veeg het werkoppervlak droog met een schone papieren handdoek. Open de vriezer en gooi het keukenpapier in de afvalcontainer.
- Dagelijks vernevelen en monitoren van eiersubstraten
OPMERKING: Voor methoden die worden gebruikt om het volume nevel dat door een spuitfles wordt geleverd te kalibreren, zie Aanvullende materialen stap 1.2.- Plaats een spuitfles over het ovipositiesubstraat zodat het tot expressie gebrachte water gelijkmatig over het oppervlak van het substraat wordt verdeeld.
- Voer het aantal pompbewegingen berekend in stap 1.2 aanvullende materialen voor elk ovipositiesubstraat dagelijks uit gedurende 11 opeenvolgende dagen.
- Controleer elke ovipositiesubstraat dagelijks en controleer op filamenteuze schimmelgroei op het oppervlak van de kokos.
- Als schimmelgroei wordt waargenomen, gebruik dan een schone lepel of scoopula om vlekken van oppervlakteschimmel te verwijderen.
- Gooi het gereedschap en de verwijderde kokos weg in de autoclaveerbare afvalcontainer die in de vriezer van de faciliteit is opgeslagen.
OPMERKING: Het is onduidelijk of de schimmel een negatieve invloed heeft op de ontwikkeling van cricket. - Begin op dag 11 na de ovipositie goed te kijken naar het substraat voor juveniele krekels.
OPMERKING: Bij 27 °C hebben de eieren van G. bimaculatus 11-13 dagen nodig om uit te komen.
- Het opzetten van geboortekooien
- Selecteer twee ongebruikte commerciële eierdoosplaten van 30,8 cm x 30,8 cm (12 inch x 12 inch). Snijd deze met een gebruiksmes of sterke schaar in zes afzonderlijke stroken van 10,1 cm (4") breed van gelijke grootte. Borstel de snijranden met de handen af om bungelende stukjes karton te verwijderen.
- Plaats de zes afzonderlijke stukken karton van 10,1 cm x 30,8 cm (4 inch x 12 inch) verticaal in de bodem van de kooi met de langere as van de doos die de smallere horizontale as van een kooi van 29,3 liter overspant. Leg een zevende stuk karton plat over de bovenkant van de zes rechtopstaande stukken.
- Selecteer drie stukken ruw bruin keukenpapier van ongeveer 25 cm x 25 cm. Vouw ze doormidden. Plaats er twee zodanig dat ze de bovenkant van de proximale kant van de kartonstructuur bedekken. Plaats er een over de kartonstapel aan de distale kant.
- Verplaats op dag 11 na de ovipositie het ovipositiesubstraat naar de proximale rechterhoek van de kooi.
- Zorg voor vroege instars
OPMERKING: Op dag 14 na de ovipositie zullen de meeste levensvatbare eieren zijn uitgekomen en zullen krekelnimfen in een vroeg stadium voer en water nodig hebben. Jonge krekels zijn niet in staat om de oppervlaktespanning van waterdruppels te doorbreken en kunnen verdrinken als er water in hun omgeving wordt opgevangen. Ze zijn echter ook gevoelig voor uitdroging. Het bieden van een consistente relatieve luchtvochtigheid van ongeveer 60% tijdens deze fase van ontwikkeling is belangrijk om overleving te garanderen.- Wanneer een luik wordt waargenomen, benevelt u de papieren handdoeken die in stap 1.4.3 over de bovenkant van de dozen zijn geplaatst totdat ze bevochtigd zijn maar niet actief water afgeven.
- Veeg beide zijden van een petrischaaldeksel van 100 mm grondig af met 70% ethanol en laat het drogen. Gebruik het als de houder waarin krekelvoer wordt afgeleverd.
OPMERKING: First-instar krekels vereisen kleinere voedingsdeeltjes dan krekels in volgende stadia van ontwikkeling. Dit fijnere voer moet de eerste 20 dagen na opkomst aan krekels worden toegediend. - Schep 50 g van het voer in een 60 watt single-serving blender en fres op 10.000 rpm gedurende 1 min.
- Meet 1 g van het voer en schud het op het petrischaaldeksel in de kooi. Gebruik het schone uiteinde van een lepel of scoopula en verdeel het voer zo gelijkmatig mogelijk over de bodem van het gerecht.
- Vervang het voer om de 2 dagen. Gebruik het uiteinde van de lepel om krekels uit de voerschaal te borstelen voordat u deze verwijdert. Gooi het oude voer weg in de autoclaveerbare afvalcontainer.
- Monitor voor schimmelgroei op voer. Als het voer wit of groenachtig begint te lijken, gooit u de petrischaal weg en voert u onmiddellijk.
- Gebruik 14 dagen na de ovipositie een verfkwast van 2,54 cm (1 inch) om krekels te verwijderen die zich vastklampen aan het natale kokossubstraat door alle krekels van het kokosoppervlak en de zijkanten van de petrischaal in de kooi te borstelen.
- Plaats het verwijderde ovipositiesubstraat in de autoclaveerbare afvalcontainer en bewaar deze in de vriezer tot het autoclaveren is.
- Vervang het natale substraat door een verse kokosschaal voor hydratatie bereid volgens de stappen 1.1.5-1.1.9.
- Gebruik een DI-waterwasfles om water toe te voegen totdat het oppervlak van de kokos glinstert, maar niet poolt.
OPMERKING: Cricketdichtheid heeft een sterke invloed op de groeiprestaties in G. bimaculatus13. Het in stand houden van het fokbestand met een te grote dichtheid loopt het risico ongewenste door drukte geïnduceerde epigenetische effecten te introduceren in experimenten waarin hun nageslacht wordt gebruikt9. Krekels moeten worden "verdund" uit de hoge dichtheden die uit de ovipositiesubstraten komen en worden verdeeld in dichtheden die voldoen aan de norm van 0,005 krekels / cm3 van de ruimte.
2. Zorg voor instars drie tot volwassene
- Kooien opzetten
OPMERKING: Voor meer informatie over de techniek om het afgeschermde deksel te construeren, zie aanvullende materialen stap 1.3.1.- Herhaal stap 1.4.1.
- Installeer vijf gesneden eierdoosstukken in het distale uiteinde van de kooi, zodat de eivormige holtes naar buiten zijn gericht. Zorg ervoor dat de korte uiteinden ongeveer aan de zijkanten van de kooi liggen, de lange kant plat tegen de bodem zit en er ongeveer 3 cm ruimte is tussen elk stuk karton.
- Plaats het laatste gesneden kartonnen stuk bovenop de rechtopstaande kartonnen stukken zoals het dak op een huis zoals weergegeven in aanvullende figuur S1.
- Volg stap 1.1.8-1.1.13 om de hydratatiesubstraten voor te bereiden.
- Plaats het hydratatiesubstraat in de proximale rechterhoek van de krekelkooi, zoals weergegeven in aanvullende figuur S2.
- Gebruik een wasfles om 6-10 ml DI-water toe te voegen totdat het kokosoppervlak nat en reflecterend lijkt, maar het kokos niet volledig is ondergedompeld.
OPMERKING: Het oppervlak moet licht gerimpeld lijken, waarbij de oppervlaktespanning ervoor zorgt dat het water de contouren van de kokos volgt. - Keer het deksel van een petrischaaltje van 100 mm om en plaats het op de proximale linkerkant van de kooi. Voeg 2-3 g standaard krekelvoer toe zoals weergegeven in aanvullende figuur S2.
- Koloniedichtheid wijzigen
OPMERKING: Voer deze stap uit 20 dagen na het uitkomen of wanneer de krekels een gemiddelde massa van 0,01 g bereiken.- Plaats op het werkoppervlak een grote container die plaats biedt aan de plattegrond van drie kooien van 29,3 L die naast elkaar staan.
OPMERKING: Dit is secundaire containment en zal krekels beheersen die ontsnappen tijdens hun overdracht van de ene kolonie naar de andere. - Verwijder de oorspronkelijke kolonie uit het opfokrek en plaats deze op het werkoppervlak.
- Plaats aan de rechterkant van de oorspronkelijke kolonie een lege kooi van dezelfde grootte.
- Plaats aan de rechterkant van de lege kooi een kooi die is opgesteld volgens stappen 2.1.1-2.1.7.
- Controleer of krekels zich niet vastklampen aan de onderkant van het afgeschermde deksel van de kooi met de krekels. Als je ze observeert, tik je op de bovenkant van de kooi om ze los te maken.
- Open het afgeschermde deksel van de kooi met daarin de krekels.
- Breng in één zachte, vloeiende beweging de doos "dak" en alle krekels die zich aan de contouren houden over in de middelste kooi.
- Zodra de doos zich in de middelste kooi bevindt, roert u het karton voorzichtig tegen de zijkanten om alle krekels los te maken.
- Controleer visueel of alle krekels zijn losgeschud voordat u het kartonstuk terugbrengt naar de proximale kant van de kooi van herkomst, zodat de resterende krekels zich aan de doos kunnen hechten.
- Herhaal stap 2.2.8-2.2.9 met alle kartonnen stukken in de kooi, waarbij u achtereenvolgens van de voorkant naar de achterkant van de oorspronkelijke kooi werkt totdat alle krekels in de middelste kooi zijn overgebracht.
- Kantel voorzichtig de middelste kooi met de krekels zodat alle krekels in de onderste hoek zijn gericht.
- Til de kooi met de krekels over de ontvangende kooi.
- Kantelen de donorkooi langzaam zodat de krekels aan de zijkanten aankoop beginnen te krijgen en op een gecontroleerde manier uit de massa in de benedenhoek kunnen bewegen, zoals weergegeven in aanvullende figuur S3.
- Als krekels te snel vooruitgaan, pas dan de hoek aan waaronder de middelste kooi wordt gehouden, waardoor de krekels terugvallen.
- Terwijl de kooi gekanteld is, gebruikt u een penseel van 2,54 cm (1 inch) om de krekels in de ontvangende kooi te leiden en telt u elk totdat het totale aantal gelijk is aan 150 personen. Gebruik de borstel om degenen af te schrikken die te snel vooruitgaan voor een nauwkeurige telling.
- Label de nieuw gevulde krekelkooi met datum, ouderlijke voorraad en het aantal krekels.
- Euthanaseer overtollige krekels die zich nog op de bodem van de middelste en originele containers bevinden op humane wijze door de hele container minimaal 30 minuten in een vriezer bij -20 °C te plaatsen.
- Inspecteer de kooi van herkomst om er zeker van te zijn dat alle krekels zijn overgebracht.
- Plaats de krekelkooien op plantenkweekrekken 25 cm onder lichtkappen met full-spectrum fluorescentielampen die zijn ingesteld op een residentiële buitentimer die is geprogrammeerd om een L / D-fotoperiode van 12 uur te behouden. Zie aanvullende figuur S4.
- Breng alle frass, schotels met verbruikt hydratatiesubstraat en -voer, papieren handdoek, exuviae en dode krekels die in de kooi van herkomst achterblijven over in de autoclaveerbare afvalcontainer.
- Tenzij het afval onmiddellijk moet worden geautoclaveerd, bewaart u het in een vriezer in de faciliteit bij -20 °C.
- Inspecteer de vloer, werkkleding, secundaire containmentkooi en werkoppervlak op ontsnapte krekels.
- Ontsmet het werkoppervlak en de secundaire containmentkooi met 10% bleekoplossing en gooi de papieren handdoeken weg in de autoclaveerbare afvalcontainer.
- Plaats op het werkoppervlak een grote container die plaats biedt aan de plattegrond van drie kooien van 29,3 L die naast elkaar staan.
- Voeren en drenken
- Open de luchtdichte voeropslagcontainer en vul een lege monsterbeker van 100 ml met krekelvoer. Reik in elke kolonie en deponeer een kwart van het voer in de beker in het petrischaaldeksel dat het voer vasthoudt.
- Om krekels water te geven, bereidt u een petrischaal met kokos volgens de stappen 1.1.9-1.1.13.
- Verhoog de voersnelheid in verhouding tot het verbruik om de beschikbaarheid van ad libitum-voer te garanderen.
OPMERKING: De vraag naar cricketfeeds verandert tijdens de ontwikkeling.
- Krekels overbrengen naar schone kooien
- Breng de krekels om de 2 weken over naar schone kooien. Repliceer de opstelling van de kooien uit stappen 2.2.1-2.2.4
OPMERKING: Aanzienlijke hoeveelheden frass zullen zich hebben opgehoopt in de concaviteiten van de eierdozen. - Breng krekels over naar schone kooien en volg de stappen 2.2.5-2.2.23.
- Manoeuvreer de dozen voorzichtig zodat de meerderheid van de frass in de kooi van oorsprong valt, terwijl krekels zich aan de doos kunnen vastklampen tijdens herhaling van stappen 2.2.7-2.2.10.
- Gebruik een borstel of plastic lepel om krekels die vastzitten in de frass aan te moedigen om van de middelste kooi naar een schone kooi te gaan.
- Inspecteer de kooi van herkomst om er zeker van te zijn dat alle krekels zijn overgebracht.
- Breng alle frass, schotels met verbruikt hydratatiesubstraat en -voer, papieren handdoek, exuviae en dode krekels die in de kooi van herkomst achterblijven over in de autoclaveerbare afvalcontainer.
- Tenzij het afval onmiddellijk moet worden geautoclaveerd, bewaart u het in een vriezer in de faciliteit bij -20 °C.
- Inspecteer de vloer, werkkleding, secundaire containmentkooi en werkoppervlak op ontsnapte krekels.
- Ontsmet het werkoppervlak en de secundaire containmentkooi met 10% bleekoplossing en gooi papieren handdoeken weg in een autoclaveerbaar afvalrecipiënt.
- Breng de krekels om de 2 weken over naar schone kooien. Repliceer de opstelling van de kooien uit stappen 2.2.1-2.2.4
- Opzetten van experimentele kooien
OPMERKING: Experimentele kooien zijn plastic containers die minder krekels huisvesten. Hun opstelling is identiek aan de kooien van 29,3 L die fokdieren bevatten, maar afhankelijk zijn van containers van 7,1 L gevuld met kleinere schalen met water, voer en een kleiner oppervlak van eierdozen bevatten.- Plaats zes kartonstukken van 10,1 cm x 15,4 cm (4 inch x 6 inch) in het distale uiteinde van elke experimentele kooi met de lange assen van de dozen over de breedte van de smalle afmeting van de kooi en de korte assen van de dozen gericht op het deksel en de vloer.
- Verpak 10 g van de gehydrateerde kokoswerkmix in een petrischaaltje.
- Gebruik een wasfles met DI-water om ongeveer 15 ml DI-water toe te voegen, of totdat zich een meniscus vormt aan het oppervlak van de kokos.
- Keer het deksel van een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm om om het voer vast te houden.
OPMERKING: De voedingssnelheid kan variëren gedurende de duur van het onderzoek. Voor de experimentele kooikrekel randomisatie- en kousenprocedure, zie Aanvullende materialen stap 1.4.
- Insecten beëindigen
- Wanneer de krekels niet langer nodig zijn voor kweek of experimenteel gebruik, volgt u stap 2.2.17.
- Als de krekels dood zijn, haal je de kooi uit de vriezer. Verwijder het deksel en breng alle ingesloten materialen over in een autoclaveerbaar afvalrecipiënt. Breng het afval terug in de vriezer totdat het autoclaveert.
- Dompel de lege kooi onder in een bleekoplossing van 10% en laat deze minimaal 5 minuten zitten.
- Spoel de lege kooi driemaal af met koud kraanwater om de bleekresten te verwijderen, met bijzondere aandacht voor kanalen op de bodem van de container.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens die aantonen dat cricket succesvol is opgefokt van uitkomen tot 65 dagen oud, werden verzameld tijdens een voerproef van september 2021. Krekels werden gekweekt uit eieren volgens stap 1.1.1-2.6.1 van deze protocollen, en zes replicaskooien werden gevuld met 24 willekeurige 22 dagen oude (derde instar) krekels na stap 2.7 hierboven. Krekels werden vervolgens gekweekt in omgevingsomstandigheden; als gevolg van een defecte luchtbehandelingseenheid van de faciliteit was de gemiddelde kamertemperatuur echter 25 ± 1 °C bij 20% relatieve vochtigheid in plaats van de voorgestelde 27 °C. De krekelmassa werd twee keer per week gemeten tussen 22 en 65 dagen na het uitkomen. De resultaten van dit experiment worden hieronder beschreven en worden gepresenteerd als gemiddelde plus of min standaarddeviatie.
De gegevens in figuur 1 en figuur 2 geven de zes replicakooien weer die het in dit protocol beschreven standaardvoer hebben toegediend. Krekels werden opgeslagen uit een populatie met een gemiddelde massa van 21 ± 9 mg. Aan het einde van het experiment was de gemiddelde massa van alle gecombineerde juveniele en volwassen krekels 0,724 g ± 0,190 g (figuur 1). Omdat G. bimaculatus seksueel dimorf is, rapporteren we ook volwassen massa per geslacht. De geslachtsverhouding bij de oogst was 51% vrouwelijk. Van de 30 volwassen mannen die aanwezig waren op de leeftijd van 65 dagen toen het experiment eindigde, was de gemiddelde massa 0,721 g ± 0,123 g. Van de 58 volwassen vrouwtjes die op de leeftijd van 65 dagen aanwezig waren, was de gemiddelde massa 0,841 g ± 0,112 g (figuur 2). De overleving tussen de bezetting en de oogst was 89% en werd wekelijks gemeten aan de hand van de totale tellingen van alle individuele krekels in alle kooien. Op dag 65 had 68,2% van alle krekels de volwassen instar bereikt (figuur 2).
Figuur 1: Gemiddelde massa van individuele krekels 22-65 dagen na het uitkomen. Staven vertegenwoordigen kwartielen van de gemiddelde krekelmassa per kooi, n = 6 kooien. Alle krekels werden 2x per week geteld en gewogen, behalve in 1 week van het experiment, waarin ze slechts één keer werden gewogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gemiddelde volwassen cricketmassa naar geslacht aan het einde van het experiment. Mannelijke krekels n = 30, vrouwelijke krekels n = 58. Staven vertegenwoordigen kwantielen van gemiddelde massa; 'x' staat voor gemiddelde krekelmassa naar geslacht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende materialen: (1) Kokosvezel en ademhalingsveiligheid, (2) Het verwijderen van kokosvezelmateriaal, (3) Kalibratie van nevelafgifte, (4) Gescreende dekselconstructie, (5) Experimentele kooikous, (6) Randomiseren van krekels naar kooien, (7) Methoden die worden gebruikt voor voeranalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Zijaanzicht van de krekelkooi met de juiste opstelling van kartonnen kartonnen kartonnen refugia, voer en kokosvezel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Bovenaanzicht van petrischalen met kokosvezel en krekelvoer op de bodem van de kooi. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Krekels die van de bodem van een kooi naar een nieuwe kooi worden overgebracht door langzaam te kantelen zoals beschreven in stap 2.2.11-2.2.13. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Kooien met krekels die op verlichte opfokrekken zijn geplaatst. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: (1) Voedingsanalyses van commerciële diervoeders, (2) Lijst van diervoederingrediënten van de fabrikant. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eenvoud van deze benadering van cricketopfok kan een reeks onderzoeksgebieden ten goede komen en vertegenwoordigt een generieke sjabloon voor succesvolle cricketteelt, gemakkelijk aan te passen aan een verscheidenheid aan experimentele behoeften. In vergelijking met verschillende andere studies van G. bimaculatus is de individuele volwassen lichaamsgrootte kleiner en de rijping langzamer14, wat we toeschrijven aan suboptimale opfoktemperatuur die ons door omstandigheden wordt opgelegd. De hierboven beschreven methoden zijn in de loop van 2 jaar gebruikt en verfijnd. Robuuste culturen zijn in stand gehouden zonder aanwijzingen voor problemen die soms worden waargenomen in de commerciële cricketteelt, waaronder wijdverspreide sterfte door pathogenen met klassieke klinische symptomen (bijv. Interne vloeibaarheid als gevolg van densovirussen in Acheta domesticus) of overmatig kannibalisme15. Het is waarschijnlijk dat het gebrek aan cricketintroducties na de vestiging van kolonies de kans op ziektelast aanzienlijk verminderde.
Het voorkomen van drukte is belangrijk om de gezondheid van cricket te waarborgen. Wilde G. bimaculatus zijn solitair en mannetjes verdedigen hun territorium door agressieve vertoningen en vechten16. Succesvolle zorg in gevangenschap vereist het binnen een geschikt bereik houden van koloniedichtheid om antagonistisch gedrag en algemene stressreacties te verminderen13. Dit wordt bereikt door krekels te voorzien van overvloedige schuilplaatsen binnen de kooi en door de fokbestanden van krekels uit te dunnen tot 150 individuen per kooi van 29,3 L op 20 dagen na het uitkomen wanneer ze een gemiddelde grootte van 0,01 g bereiken, tijdens de derde of vierde juveniele instar. Deze opfokdichtheid is identiek aan die gebruikt in de G. bimaculatus voeroptimalisatieproeven van Sorjonen et al.14. Een overweging van bijzonder belang bij de overdracht van krekels van de ene container naar de andere is de hoge mate van ontsnappingsrisico. Secundaire insluiting, gecontroleerde bewegingen, voorbereiding om ontsnapten te arresteren en waakzaamheid zijn cruciale hulpmiddelen om te voorkomen dat cricket tijdens dit proces ontsnapt. Dergelijke maatregelen weerspiegelen de aanwijzing van Gryllus spp. krekels als potentiële gewasplagen, waarvoor federale en staatsvergunningen nodig zijn voor het fokken in de Verenigde Staten17.
Milieucontroles en voederkwaliteit tijdens ei- en vroege nimfstadia zijn belangrijk voor de gezondheid van alle krekelculturen in gevangenschap, inclusief G. bimaculatus. Om levensvatbare eieren te leggen, heeft vrouwelijke G. bimaculatus een vochtig substraat nodig om18 te oviponit. Kokosvezel wordt veel gebruikt in de commerciële cricketproductie-industrie als een medium voor ovipositie. Deze methoden zijn gebaseerd op kokosvezel bevochtigd met DI-water als substraat voor zowel ovipositie als hydratatie van krekels gedurende hun levenscyclus. Evenzo is het gebruik van vochtige papieren handdoeken in juveniele kooien om overtollige waterdruppels te absorberen en vochtigheidsgradiënten in de natale omgeving te bieden, zeer effectief gebleken bij het verminderen van het aantal krekels van <1 week oud die bezwijken aan uitdroging of verdrinking, zoals blijkt uit de aanwezigheid of afwezigheid van overleden juveniele krekels in kooibodems. Van juveniele voeding is bekend dat het een buitenmaatse rol speelt bij het voorspellen van succesvolle groeiprestaties bij krekels. Ervoor zorgen dat vers volledig voedingsvoer een deeltjesgrootte heeft die geschikt is voor krekels van <0,01 g, zal leiden tot een hogere overlevingskansen, omdat jongere krekels gevoeliger zullen zijn voor de effecten van variabiliteit in voerkwaliteit19.
Het commercieel beschikbare krekelvoer dat in deze studie werd gebruikt, werd geselecteerd vanwege het wijdverbreide gebruik ervan in de Noord-Amerikaanse cricketlandbouwindustrie. Ten eerste, uit persoonlijke communicatie met drie commerciële cricketboeren, twee in de Upper Midwest US en één in de zuidelijke VS, is het duidelijk dat dit voer (Mazuri) tot op heden op grote schaal wordt toegepast in de eetbare insectenindustrie. Cricketboeren vinden het vatbaar voor wenselijke groeiprestaties, vruchtbaarheid, ontwikkeling en gewichtstoenamestatistieken. Ten tweede, voor technici die belast zijn met het toedienen van voer aan grote aantallen krekels in laboratoriumomgevingen, is het handig om één poedervormig voorgemengd voer te gebruiken gedurende de levensduur van de insecten. Ten derde is bekend dat de eiwitvraag een belangrijke factor is in de ontwikkeling van cricket en hoewel veel andere specifieke voedingsbehoeften voor G. bimaculatus niet volledig worden begrepen, bevat deze voorgevormde mix een ruw eiwitpercentage, dat binnen het gerapporteerde optimale bereik van 22% -30% 14,20 valt.
De ruimte in incubators is vaak beperkt. Cricketboerderijen beginnen hun vroege krekels meestal in incubators en brengen meer volwassen dieren over naar openluchtomgevingen, waar luchtbehandelingssystemen voor de hele faciliteit de temperatuur en vochtigheid regelen. Om deze redenen zijn deze methoden ontworpen om dergelijke regelingen op kleinere schaal na te bootsen. Na 20 dagen in de incubator wordt de dichtheid verminderd en worden krekels overgebracht naar experimentele behandelingen of naar omgevingsomstandigheden voor gebruik als fokdieren. Wanneer luchtbehandelingssystemen naar behoren functioneren, moet de temperatuur van de houderijfaciliteit een stabiele 27 ± 1 °C zijn met een relatieve vochtigheid tussen 20% en 25%. Krekels krijgen ad libitum toegang tot water en voer. Het voer waarnaar in deze methoden wordt verwezen, is Mazuri Cricket Feed dat veel wordt gebruikt door cricketboeren in Noord-Amerika. Voor een volledige voedingsanalyse, zie Aanvullende tabelS1.
Volgens de methoden van Donoughe en Extavour (2016) mag watten worden gebruikt in plaats van kokosvezel als ovipositiemedium of als omhulselmateriaal bovenop de kokos om te voorkomen dat deeltjes frass of voer het oppervlak van het ovipositiemedium besmetten18. Ze raden aan om tijdens de ovipositieperiode een dunne laag watten over het substraat te plaatsen en vervolgens te verwijderen zodra de ovipositie is voltooid, samen met de opgehoopte frass en het afval. Hoewel gegevens die de impact van substraatbesmetting op de levensvatbaarheid van eieren of de ontwikkeling van krekels meten niet beschikbaar zijn, leveren de hier geschetste protocollen bevredigende resultaten op, zowel bij de productie van juveniele krekels als bij de groei. Dit kan te wijten zijn aan de vermeende antimicrobiële eigenschappen van kokosvezel en is reden voor toekomstig onderzoek op het gebied van de productie van eetbare insecten21.
Als gevolg van een storing van de eenheid die de temperatuur regelt van de cricketopfokfaciliteit waarin deze methoden zijn ontwikkeld, werd de proef waarvoor we gegevens rapporteren uitgevoerd bij 25 ° C bij 20% relatieve vochtigheid, wat 2 ° koeler is dan deze protocollen voorschrijven. Bovendien resulteren deze eng op voer gebaseerde onderzoeksdoelen in beperkte beschikbaarheid van gegevens over bepaalde metrieken van belang, zoals vruchtbaarheid, endocriene reacties, pathogene belasting en genexpressie. Zodra broedende krekels consequent overvloedige levensvatbare krekeleieren produceerden en de juveniele sterfte verwaarloosbaar werd waargenomen, waren de inspanningen voornamelijk gericht op experimenten die direct relevant zijn voor onderzoeksvragen. Dit rapport biedt dus alleen anekdotische verslagen van de langetermijneffecten van deze methoden op groeiprestaties over >10 generaties. Ten slotte leidt het gebruik van plantaardige materialen zoals kokos en karton in experimentele kooien waarschijnlijk tot incidentele inname door krekels. Dit is aanvaardbaar binnen de opzet van deze studies, maar kan de validiteit van onderzoeksopzet in gevaar brengen wanneer de bevindingen gebaseerd zijn op nauwkeurige metingen van de totale ingenomen biomassa.
Het hier beschreven protocol is bedoeld om zowel basis als grondig te zijn, met duidelijke en gemakkelijk te volgen stappen voor het haalbaar grootbrengen van krekels in een laboratoriumomgeving gevoed met een in de handel verkrijgbaar standaardvoer. Het gebruik van een dergelijke gestandaardiseerde procedure met optimale reiniging, bezettingsdichtheid en omgevingscontroles maakt het mogelijk om uniforme en gezonde krekelkolonies op lange termijn te behouden; bovendien zal het bijdragen aan het groeiende onderzoek naar G. bimaculatus als een kweekbaar eetbaar insect met implicaties voor de menselijke gezondheid. Het kan ook nuttig zijn voor studies over insectenfysiologie, groeioptimalisatie en genetica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Financiering voor dit project werd mogelijk gemaakt door interne subsidies van de Universiteit van Wisconsin-Madison. Oprechte dank aan Kevin Bachhuber van Bachhuber Consulting Inc. voor toegang tot zijn ongepubliceerde gids voor commerciële cricketopfok en aan Michael Bartlett Smith voor zijn hulp bij het verfijnen en oplossen van problemen met deze methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3430CLBL | Used to house breeding stock |
| 3-tier/12-tray Grow Light Stand | Fischer Scientific | NC1938548 | |
| 50-gal (189.27L) tote bin with lid | Sterilite | #14796603 | Used as secondary containment when handling crickets |
| 50 mL polypropylene graduated cylinder | Fischer Scientific | S95171 | |
| 7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid | HOMZ | 3410CLBL | Used to house exprimental stock |
| Accuris 500 g x 0.01 g Balance | Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific | W3300-500 | Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+" |
| Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush | Ace Hardware | #1803261 | |
| Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle | Fischer Scientific | 03-421-160 | |
| Bright aluminum window screen | Phifer | UNSPSC# 11162108 | Mesh size 18 x 16" |
| Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids | Wal-Mart | N/A | |
| Deionized water | |||
| Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade | Home Depot | #313114935 | |
| Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" | Uline | S-5189 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875714 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm | Fischer Scientific | FB0875713A | |
| Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels | Home Depot | #205675843 | |
| Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks | Infinity Bond | Infinity IM-Tough-Guy-12 | |
| Mazuri Cricket Diet | Land O' Lakes International | SKU# 3002219-105 | |
| Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer | Wal-Mart | N/A | |
| Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block | Home Depot | #300679904 |
References
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Merkel, G. The effects of temperature and food quality on the larval development of Gryllus bimaculatus (Orthoptera, Gryllidae). Oecologia. 30 (2), 129-140 (1977).
- Bateman, P. W. Mate preference for novel partners in the cricket Gryllus bimaculatus. Ecological Entomology. 23 (4), 473-475 (1998).
- Mito, T., Noji, S. The two-spotted cricket Gryllus bimaculatus: An emerging model for developmental and regeneration studies. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Ylla, G., et al. Cricket genomes: the genomes of future food. BioRxiv. , (2020).
- Hanboonsong, Y., Jamjanya, T., Durst, P. B. Six-legged livestock: edible insect farming, collecting, and marketing in Thailand. , Available from: http://www.fao.org/docrep/017/i3246e00.htm (2013).
- Halloran, A., Roos, N., Hanboonsong, Y. Cricket farming as a livelihood strategy in Thailand. Geographical Journal. 183 (1), 112-124 (2017).
- Wade, M., Hoelle, J. A review of edible insect industrialization: scales of production and implications for sustainability. Environmental Research Letters. 15, 123013 (2020).
- EL-Damanhouri, H. I. H. Studies on the influence of different diets and rearing conditions on the development and growth of the two-spotted cricket Gryllus bimaculatus de Greer. , Available from: https://epub.uni-bayreuth.de/310/1/Diss.pdf (2011).
- Ngonga, C. A., Gor, C. O., Okuto, E. A., Ayieko, M. A. Growth performance of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus production reared under improvised cage system for increased returns and food security. Journal of Insects as Food and Feed. 7, 301-310 (2021).
- Behrens, W., Hoffmann, K. -H., Kempa, S., Gäßler, S., Merkel-Wallner, G. Effects of diurnal thermoperiods and quickly oscillating temperatures on the development and reproduction of crickets, Gryllus bimaculatus. Oecologia. 59 (2-3), 279-287 (1983).
- Collavo, A., et al. Housecricket smallscale farming. Ecological implications of minilivestock. Potential of insects, rodents, frogs and snails. Paoletti, M. G. , Science Publishers. Enfield, N.H., USA. Chapter 27 (2005).
- Simmons, L. W. Competition between larvae of the field cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae) and its effects on some life-history components of fitness. Journal of Animal Ecology. 56, 1015-1027 (1987).
- Sorjonen, J. M., et al. The plant-based by-product diets for the mass-rearing of Acheta domesticus and Gryllus bimaculatus. PLOS ONE. 14 (6), 0218830 (2019).
- Maciel-Vergara, G., Jensen, A. B., Lecocq, A., Eilenberg, J. Diseases in edible insect rearing systems. Journal of Insects as Food and Feed. 7 (5), 1-18 (2021).
- Alexander, R. D. Aggressiveness, territoriality, and sexual behavior in field crickets (Orthoptera: Gryllidae). Behaviour. , 130-223 (1961).
- Pet food, fish bait, and animal feed. USDA APHIS. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planhealth/import-information/permits/plant-pests/sa_animalfeed/ct_petfood_fishbait_animalfeed (2022).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. 411 (1), 140-156 (2016).
- Dobermann, D., Michaelson, L., Field, L. M. The effect of an initial high-quality feeding regime on the survival of Gryllus bimaculatus (black cricket) on bio-waste. Journal of Insects as Food and Feed. 5 (2), 1-8 (2018).
- Lundy, M. E., Parrella, M. P. Crickets are not a free lunch: Protein capture from scalable organic side-streams via high-density populations of Acheta domesticus. PLOS ONE. 10, 0118785 (2015).
- Mazaya, G., Karseno, K., Yanto, T. Antimicrobial and phytochemical activity of coconut shell extracts. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology. 8 (5), 1090-1097 (2020).
