Этот протокол описывает флуоресцентную визуализацию и анализ эндогенных метаболических коферментов, восстановленного динуклеотида никотинамидаденина (фосфата) (NAD(P)H) и окисленного флавинадениндинуклеотида (FAD). Автофлуоресцентная визуализация NAD(P)H и FAD обеспечивает безмечаночный, неразрушающий метод оценки клеточного метаболизма.
Клеточный метаболизм — это процесс, посредством которого клетки вырабатывают энергию, и многие заболевания, включая рак, характеризуются аномальным метаболизмом. Восстановленный никотинамид аденин (фосфат) динуклеотид (NAD(P)H) и окисленный флавинадениндинуклеотид (FAD) являются коферментами метаболических реакций. NAD(P)H и FAD проявляют автофлуоресценцию и могут быть спектрально изолированы волнами возбуждения и излучения. Оба кофермента, NAD(P)H и FAD, могут существовать либо в свободной, либо в связанной с белком конфигурации, каждая из которых имеет различное время жизни флуоресценции – время, в течение которого флуорофор остается в возбужденном состоянии. Флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) позволяет количественно оценить интенсивность флуоресценции и время жизни NAD(P)H и FAD для анализа клеточного метаболизма без меток. Микроскопы с интенсивностью флуоресценции и сроком службы могут быть оптимизированы для визуализации NAD(P)H и FAD путем выбора соответствующих длин волн возбуждения и излучения. Метаболические возмущения цианидом проверяют протоколы автофлуоресцентной визуализации для обнаружения метаболических изменений в клетках. В данной статье будет продемонстрирована методика автофлуоресцентной визуализации NAD(P)H и FAD для измерения клеточного метаболизма.
Метаболизм – это клеточный процесс производства энергии. Клеточный метаболизм охватывает несколько путей, включая гликолиз, окислительное фосфорилирование и глутаминолиз. Здоровые клетки используют эти метаболические пути для выработки энергии для пролиферации и функционирования, такой как производство цитокинов иммунными клетками. Многие заболевания, включая нарушения обмена веществ, рак и нейродегенерацию, характеризуются измененным клеточным метаболизмом1. Например, некоторые типы раковых клеток имеют повышенные скорости гликолиза, даже в присутствии кислорода, для генерации молекул для синтеза нуклеиновых кислот, белков и липидов2,3. Это явление, известное как эффект Варбурга, является отличительной чертой многих типов рака, включая рак молочной железы, рак легких и глиобластомы4. Из-за изменений клеточного метаболизма, связанных с прогрессированием рака, клеточный метаболизм может быть суррогатным биомаркером лекарственного ответа5,6. Кроме того, понимание эффективности лекарств на клеточном уровне имеет решающее значение, поскольку гетерогенность клеток может привести к различным реакциям на лекарства у людей7,8.
Технологии, которые идентифицируют и количественно оценивают изменения в клеточном метаболизме, необходимы для исследований рака и лекарственного ответа. Химические и белковые анализы используются для оценки метаболизма клеток или тканей, но им не хватает одноклеточного разрешения и пространственной информации. Анализы на основе считывателя метаболических пластин могут измерять рН и потребление кислорода в образце с течением времени и последующее метаболическое возмущение химическими веществами. pH может быть использован для расчета скорости внеклеточного подкисления (ECAR), что дает представление о гликолитической активности клеток9. Методы визуализации всего тела, включая 2-[фтор-18] фтор-D-глюкозо-позитронно-эмиссионную томографию (FDG PET) и магнитно-резонансную спектроскопию (MRS), являются неинвазивными методами визуализации, используемыми клинически для выявления рецидива опухоли и эффективности лекарств с помощью метаболических измерений10,11,12,13,14.
FDG-PET изображает поглощение тканями FDG, радиомаркированного аналога глюкозы. Повышенное поглощение ФДГ-ПЭТ опухолями относительно окружающих тканей обусловлено эффектом Варбурга12,13. MRS изображает общие ядра молекул, используемых для метаболизма, таких как 13C и 31P, и может получать динамическую информацию о том, как метаболизм изменяется в ответ на стимулы, такие как физические упражнения или еда14. Хотя ФДГ-ПЭТ и МРС могут использоваться клинически, этим технологиям не хватает пространственного разрешения для разрешения внутриопухолевой гетерогенности. Аналогичным образом, измерения потребления кислорода производятся на массовой популяции клеток. Автофлуоресцентная визуализация преодолевает препятствие пространственного разрешения этих технологий и обеспечивает неинвазивный метод количественной оценки клеточного метаболизма.
Рисунок 1: NADH и FAD в общих метаболических путях. NADH и FAD являются коферментами, используемыми в гликолизе, цикле Кребса и цепи переноса электронов. Автофлуоресцентная визуализация этих молекул предоставляет информацию о клеточном метаболизме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Восстановленный никотинамид аденин (фосфат) динуклеотид (NAD(P)H) и окисленный флавинадениндинуклеотид (FAD) являются коферментами метаболических реакций, включая гликолиз, окислительное фосфорилирование и глутаминолиз (рисунок 1). Как NAD(P)H, так и FAD являются автофлуоресцентными и обеспечивают эндогенный контраст для флуоресцентной визуализации1,15. NADPH обладает свойствами, аналогичными свойствам NADH. Из-за этого NAD(P)H часто используется для представления комбинированного сигнала NADH и NADPH2,16.
Флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) количественно определяет время жизни флуоресценции или время, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Время жизни флуоресценции реагирует на микроокружение флуорофоров и предоставляет информацию о клеточном метаболизме17. NAD(P)H и FAD могут существовать в клетках в связанных с белком или свободных конформациях, каждая из которых имеет различное время жизни. Свободный NAD(P)H имеет более короткий срок службы, чем связанный с белком NAD(P)H; и наоборот, свободный FAD имеет более длительный срок службы, чем связанный FAD18,19. Время жизни и вес компонентов в течение срока службы могут быть количественно определены на основе данных о распаде срока службы флуоресценции с помощью экв. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) представляет собой нормализованную интенсивность флуоресценции как функцию времени. Α 1 и α 2 в этом уравнении представляют пропорциональные компоненты короткого и длительного времени жизни (α 1+ α 2 = 1), соответственно, τ1 и τ2 представляют собой короткое и долгое время жизни соответственно, а C учитывает фоновое освещение7,20. Амплитудно-взвешенное время жизни, представленное здесь как τm, вычисляется с использованием Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
Среднее время жизни может быть вычислено путем усреднения «t» по интенсивности распада флуорофора, что для двухэкспоненциального распада показано экв. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Изображение интенсивности флуоресценции может быть вычислено на основе изображения времени жизни путем интеграции распада времени жизни флуоресценции. Автофлуоресцентная визуализация является неразрушающим и безметочным методом, который может быть использован для характеристики метаболизма живых клеток с субклеточным разрешением. Оптический окислительно-восстановительный коэффициент обеспечивает оптическую аналоговую метрику химического окислительно-восстановительного состояния клетки и рассчитывается как отношение интенсивностей NAD(P)H и FAD. Хотя формула для расчета оптического окислительно-восстановительного соотношения не стандартизирована22,23,24,25, она определяется здесь как интенсивность FAD по комбинированным интенсивностям NAD(P)H и FAD. Это определение используется потому, что суммированная интенсивность в знаменателе нормализует метрику между 0 и 1, а ожидаемым результатом ингибирования цианида является снижение окислительно-восстановительного соотношения. Время жизни флуоресценции свободных NAD(P)H и FAD дает представление об изменениях в микроокружении метаболического растворителя, включая рН, температуру, близость к кислороду и осмолярность17.
Изменения в времени жизни флуоресценции связанных фракций NAD(P)H и FAD могут указывать на использование метаболического пути и субстрат-специфический метаболизм26. Массы компонентов могут быть интерпретированы для изменения свободной до связанной фракции коэнзимов18,19. В целом, эти количественные показатели времени аутофлуоресценции позволяют анализировать клеточный метаболизм, а аутофлуоресцентная визуализация была использована для идентификации новообразований из нормальных тканей27,28, характеризующих стволовые клетки29,30, оценивающих функцию иммунных клеток31,32,33,34,35, измеряющих неврологическую активность36, 37,38, и понимание эффективности лекарств при таких типах рака, как рак молочной железы и рак головы и шеи21,39,40,41,42. Автофлуоресцентная визуализация высокого разрешения может быть объединена с сегментацией изображения для одноклеточного анализа и количественной оценки гетерогенности интрапопуляции43,44,45,46,47.
NAD(P)H и FAD могут быть визуализированы на однофотонных или многофотонных флуоресцентных микроскопах, сконфигурированных для интенсивной или пожизненной визуализации. Для однофотонных микроскопов NAD(P)H и FAD обычно возбуждаются на длинах волн 375-405 нм и 488 нм соответственно из-за общих лазерных источников на этих длинах волн48. При двухфотонном флуоресцентном возбуждении NAD(P)H и FAD будут возбуждаться на длинах волн приблизительно от 700 до 750 нм и от 700 до 900 нм соответственно15,49. Как только флуорофоры возбуждаются, NAD(P)H и FAD испускают фотоны на длинах волн от ~410 нм до ~490 нм и ~510 нм до ~640 нм, соответственно15. Длины волн максимального излучения NAD(P)H и FAD составляют приблизительно 450 нм и 535 нм соответственно48.
Из-за их различных длин волн возбуждения и излучения флуоресценция двух метаболических коферментов может быть спектрально изолирована. Понимание спектральных характеристик NAD(P)H и FAD необходимо для проектирования и оптимизации протоколов автофлуоресцентной визуализации. Цианид является ингибитором комплекса IV цепи переноса электронов (ETC). Влияние цианида на клеточный метаболизм и интенсивность аутофлуоресценции и время жизни NAD(P)H и FAD в клетках хорошо охарактеризованы27,40. Таким образом, эксперимент с возмущением цианида является эффективным средством проверки протоколов визуализации NAD(P)H и FAD. Успешный эксперимент с цианидом дает уверенность в том, что протокол визуализации NAD(P)H и FAD может быть использован для оценки метаболизма неизвестных групп или возмущений.
Интенсивность автофлуоресценции и пожизненная визуализация широко использовались для оценки метаболизма в клетках21,55. FLIM имеет высокое разрешение и, следовательно, разрешает одиночные клетки, что важно для исследований рака, поскольку клеточная гетер?…
The authors have nothing to disclose.
Источники финансирования включают Институт профилактики рака и исследований Техаса (CPRIT RP200668) и Техасский университет A & M. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
2-deoxy-d-glucose (2-DG) | Sigma | AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250 | |
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) | Gibco | 15240096 | |
Cell Samples | American Type Culture Collection | N/A | MCF-7 cancer line |
CellProfiler | Broad Institute | N/A | Image analysis software |
Conical Tube | VWR | 89039-664 | 15 mL conical tube |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Culture media |
FAD dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25×36 | 495 nm |
FAD emission filter | Semrock | FF01-550/88-25 | 550/88 nm |
FAD excitation filter | Semrock | FF01-458/64-25 | 458/64 nm |
FBS | ThermoFisher | 16000036 | |
Fluorescence Lifetime Microscope | 3i | N/A | |
Glass bottom dish | MatTek Corp | P35G-1.0-14-C | |
Multiphoton Laser | Coherent | N/A | 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm |
NAD(P)H dichroic mirror | Semrock | FF409-Di03-25×36 | 409 nm |
NAD(P)H emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | 447/60 nm |
NAD(P)H excitation filter | Semrock | FF01-357/44-25 | 357/44 nm |
PBS | ThermoFisher | 70011044 | |
Potassium Cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | |
SlideBooks 6 | 3i | N/A | Image acquisition software |
SPCImage | Becker & Hickl GmbH | N/A | Fluorescence lifetime analysis software |
Stage Top Incubator | okoLab | N/A | |
Trypsin | Biosciences | 786-262 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
YG beads | Polysciences | 19096-2 | Yg microspheres (20.0 µm) |