Imagem de autofluorescência para avaliar o metabolismo celular

Summary

Este protocolo descreve imagens de fluorescência e análise das aconzyomas metabólicas endógenas, dinucleotídeos de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeos (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina de flavina oxidada (FAD). A imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD fornece um método sem rótulos e não destrutivo para avaliar o metabolismo celular.

Abstract

O metabolismo celular é o processo pelo qual as células geram energia, e muitas doenças, incluindo o câncer, são caracterizadas pelo metabolismo anormal. Adenina de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeo (NAD(P)H) e dinucleotídeo de adenina oxidada (FAD) são aconsetos de reações metabólicas. Nad(P)H e FAD exibem autofluorescência e podem ser isolados espectralmente por comprimentos de onda de excitação e emissão. Ambos os aconzymes, NAD(P)H e FAD, podem existir em uma configuração livre ou ligada à proteína, cada uma das quais tem uma fluorescência distinta ao longo da vida – o tempo para o qual o fluorohore permanece no estado animado. A imagem vitalícia da fluorescência (FLIM) permite quantificação da intensidade da fluorescência e das vidas de NAD(P)H e FAD para análise livre de rótulos do metabolismo celular. A intensidade da fluorescência e os microscópios de vida podem ser otimizados para a imagem NAD(P)H e FAD, selecionando os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados. Perturbações metabólicas por cianeto verificam protocolos de imagem de autofluorescência para detectar alterações metabólicas dentro das células. Este artigo demonstrará a técnica de imagem de autofluorescência de NAD(P)H e FAD para medir o metabolismo celular.

Introduction

Metabolismo é o processo celular de produção de energia. O metabolismo celular abrange múltiplas vias, incluindo glicólise, fosforilação oxidativa e glutaminolise. Células saudáveis usam essas vias metabólicas para gerar energia para proliferação e função, como a produção de citocinas por células imunes. Muitas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, câncer e neurodegeneração, são caracterizadas pelo metabolismo celular ^alterado1. Por exemplo, alguns tipos de células cancerígenas têm elevadas taxas de glicólise, mesmo na presença de oxigênio, para gerar moléculas para a síntese de ácidos nucleicos, proteínas e lipídios2,3. Este fenômeno, conhecido como efeito Warburg, é uma marca registrada de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama, câncer de pulmão e glioblastomas4. Devido às alterações do metabolismo celular associadas à progressão do câncer, o metabolismo celular pode ser um biomarcador substituto para a resposta de ^drogas5,6. Além disso, entender a eficácia da droga a nível celular é crucial, pois a heterogeneidade celular pode levar a diferentes respostas medicamentosas em ^{indivíduos7,8}.

Tecnologias que identificam e quantificam mudanças no metabolismo celular são essenciais para estudos de câncer e resposta a medicamentos. Análises químicas e proteicas são usadas para avaliar o metabolismo de células ou tecidos, mas não possuem resolução unicelular e informações espaciais. Ensaios baseados em leitor de placas metabólicas podem medir o consumo de pH e oxigênio na amostra ao longo do tempo e a subsequente perturbação metabólica por produtos químicos. O pH pode ser usado para calcular a taxa de acidificação extracelular (ECAR), que fornece uma visão da atividade glicóltica das ^células9. Os métodos de imagem de todo o corpo, incluindo 2-[fluorine-18] tomografia fluoro-D-glicose e emissão de pósitrons (FDG PET) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), são modalidades de imagem não invasivas utilizadas clinicamente para identificar a recidiva do tumor e a eficácia da droga através de medições metabólicas10,11,12,13,14.

Imagens FDG-PET a absorção tecidual de FDG, um analógico de glicose radiolaterada. O aumento da absorção do FDG-PET por tumores relativos ao tecido circundante deve-se ao efeito ^Warburg12,13. Imagens mrs núcleos comuns de moléculas usadas para o metabolismo, como ^13C e ^31P, e podem obter informações dinâmicas sobre como o metabolismo muda em resposta a estímulos, como exercício ou ^comer14. Embora o FDG-PET e o MRS possam ser utilizados clinicamente, essas tecnologias carecem de resolução espacial para resolver a heterogeneidade intratumoral. Da mesma forma, as medidas de consumo de oxigênio são feitas em uma população em massa de células. A imagem de autofluorescência supera o obstáculo de resolução espacial dessas tecnologias e fornece um método não invasivo de quantificar o metabolismo celular.

Figura 1: NADH e FAD em vias metabólicas comuns. NADH e FAD são aconchegantes usados na glicólise, no ciclo de Krebs e na cadeia de transporte de elétrons. A imagem de autofluorescência dessas moléculas fornece informações sobre o metabolismo celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Adenina de nicotinamida reduzida (fosfato) dinucleotídeo (NAD(P)H) e dinucleotídeo de alcaina oxidada (FAD) são aconzyomas de reações metabólicas, incluindo glicólise, fosforilação oxidativa e glutaminolise (Figura 1). Tanto o NAD(P)H quanto o FAD são autofluorescentes e fornecem contraste endógeno para imagens de fluorescência1,15. O NADPH tem propriedades fluorescentes similares ao NADH. Por causa disso, o NAD(P)H é frequentemente usado para representar o sinal combinado de NADH e NADPH2,16.

A imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM) quantifica a vida útil da fluorescência ou o tempo para o qual um fluoróforo está no estado animado. As vidas de fluorescência são responsivas ao microambiente dos fluoroforos e fornecem informações sobre o metabolismo ^celular17. Nad(P)H e FAD podem existir dentro das células em conformações ligadas à proteína ou livres, cada uma das quais tem uma vida útil diferente. O NAD(P)H gratuito tem uma vida útil mais curta do que o NAD(P)H vinculado à proteína); por outro lado, a FAD livre tem uma vida útil mais longa do que o ^FAD18,19 vinculado. As vidas e os pesos dos componentes ao longo da vida podem ser quantificados a partir de dados de decaimento vitalício de fluorescência através de Eq. (1)²⁰:

I(t) = α ^1e-t/_τ1 + α _2e-t^/_τ2 + C (1)

Eq (1) representa a intensidade de fluorescência normalizada em função do tempo. Os α ₁ e α ₂ nesta equação representam os componentes proporcionais de vida curta e longa (α ₁+ α ₂=1), respectivamente, _τ1 e _τ2 representam as vidas curtas e longas, respectivamente, e C é responsável pela luz de ^fundo7,20. A vida útil ponderada por amplitude, representada aqui como _τm, é calculada utilizando-se de Eq. (2).

τm= α _1τ1+ α _2τ2 (2)

Uma vida média pode ser calculada pela média “t” sobre a decadência de intensidade do fluoróforo, que para uma decadência bi-exponencial é mostrado por Eq. (3)^17,21.

τ*_m= (α _1τ12+ α _2τ22)/ (α _1τ1+ α _2τ2) (3)

Uma imagem de intensidade de fluorescência pode ser computada a partir da imagem vitalícia integrando a decadência da fluorescência ao longo da vida. A imagem de autofluorescência é um método não destrutivo e livre de rótulos que pode ser usado para caracterizar o metabolismo das células vivas em uma resolução subcelular. A razão óptica redox fornece uma métrica analógica óptica do estado químico redox da célula e é calculada como a razão das intensidades NAD(P)H e FAD. Embora a fórmula para calcular a razão óptica redox não seja padronizada22,23,24,25, ela é definida aqui como a intensidade da FAD sobre as intensidades combinadas de NAD(P)H e FAD. Esta definição é usada porque a intensidade somada no denominador normaliza a métrica entre 0 e 1, e o resultado esperado da inibição de cianeto é uma diminuição na razão redox. As vidas de fluorescência do NAD(P)H e FAD gratuitos fornecem insights sobre mudanças no microambiente metabólico solvente, incluindo pH, temperatura, proximidade com oxigênio e ^{osmolaridade17}.

Alterações na vida de fluorescência das frações vinculadas de NAD(P)H e FAD podem indicar a utilização da via metabólica e o metabolismo específico do ^substrato26. Os pesos dos componentes podem ser interpretados para alterações na fração livre para a fração vinculada dos ^{aconchegantes18,19}. Ao todo, essas métricas quantitativas de vida de autofluorescência permitem a análise do metabolismo celular, e a imagem de autofluorescência tem sido utilizada para identificar neoplasias de tecidos ^normais27,28, caracterizando células-tronco29,30, avaliando a função das células imunes31,32,33,34,35, aferosa atividade ^{neurológica36, 37,38}, e entendendo a eficácia de medicamentos em tipos de câncer, como câncer de mama e câncer de cabeça e ^{pescoço21,39,40,41,42}. A imagem de autofluorescência de alta resolução pode ser combinada com segmentação de imagem para análise unicelular e quantificação da heterogeneidade intrapopulação43,44,45,46,47.

Os microscópios NAD(P)H e FAD podem ser imagens em microscópios de fluorescência de fofilas ou multifotofon configurados para intensidade ou imagens vitalícias. Para microscópios de fótons únicos, NAD(P)H e FAD são tipicamente animados em comprimentos de onda de 375-405 nm e 488 nm, respectivamente, devido a fontes de laser comuns nesses comprimentos de ^onda48. Na excitação da fluorescência de dois fótons, NAD(P)H e FAD irão excitar em comprimentos de onda de aproximadamente 700 a 750 nm e 700 a 900 nm, ^{respectivamente15,49}. Uma vez que os fluoroforos estão animados, NAD(P)H e FAD emitem fótons em comprimentos de onda entre ~410 nm a ~490 nm e ~510 nm a ~640 nm, ^{respectivamente15}. Os comprimentos de onda de emissão NAD(P)H e FAD maxima são de aproximadamente 450 nm e 535 nm, ^{respectivamente48}.

Devido à sua excitação e comprimentos de onda de emissão diferentes, a fluorescência das duas coenzimas metabólicas pode ser isolada espectralmente. É necessário compreender as características espectrais de NAD(P)H e FAD) para o projeto e otimização dos protocolos de imagem de autofluorescência. Cianeto é um inibidor complexo IV da cadeia de transporte de elétrons (ETC). Os efeitos do cianeto no metabolismo celular e nas intensidades de autofluorescência e vida útil de NAD(P)H e FAD dentro das células são bem ^{caracterizados27,40}. Portanto, um experimento de perturbação de cianeto é um meio eficaz de validar protocolos de imagem NAD(P)H e FAD. Um experimento de cianeto bem sucedido fornece confiança de que o protocolo de imagem NAD(P)H e FAD pode ser usado para avaliar o metabolismo de grupos desconhecidos ou perturbações.

Protocol

1. Revestimento de células para imagem Aspire o meio a partir de um frasco T-75 confluente de 80-90% de células MCF-7, enxágue as células com 10 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) e adicione 2 mL de 0,25% de trippsina (1x) para desprender as células do fundo do frasco. Incubar o frasco a 37 °C por ~4 min. Verifique as células sob o microscópio para confirmar o desprendimento. Adicione imediatamente 8 mL de meio de cultura para desativar a trippsina.</li…

Representative Results

A linha de células cancerígenas de mama epitelial, MCF-7, foi cultivada em DMEM suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina. Para a imagem de fluorescência, as células foram semeadas a uma densidade de 4 × 105 células por 35 mm de imagem de fundo de vidro 48 h antes da imagem. As células foram imagens antes e depois do tratamento com cianeto usando os protocolos acima indicados. O objetivo do experimento cianeto é confirmar o isolamento espectral da fluorescência NAD…

Discussion

A intensidade da autofluorescência e a imagem vitalícia têm sido amplamente utilizadas para avaliar o metabolismo nas ^{células21,55}. FLIM é de alta resolução e, portanto, resolve células únicas, o que é importante para estudos de câncer, pois a heterogeneidade celular contribui para a agressão tumoral e resistência a medicamentos7,39,41,44,45,46,58.^</sup…

Materials

2-deoxy-d-glucose (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)	Gibco	15240096
Cell Samples	American Type Culture Collection	N/A	MCF-7 cancer line
CellProfiler	Broad Institute	N/A	Image analysis software
Conical Tube	VWR	89039-664	15 mL conical tube
DMEM	ThermoFisher	11965092	Culture media
FAD dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03-25×36	495 nm
FAD emission filter	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
FAD excitation filter	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Fluorescence Lifetime Microscope	3i	N/A
Glass bottom dish	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser	Coherent	N/A	2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror	Semrock	FF409-Di03-25×36	409 nm
NAD(P)H emission filter	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H excitation filter	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
Potassium Cyanide	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Image acquisition software
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microspheres (20.0 µm)