Method Article

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

DOI:

10.3791/63282

⸱

November 15th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 내인성 대사 조효소, 환원된 니코틴아미드 아데닌(인산염) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)의 형광 이미징 및 분석을 기술한다. NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 이미징은 세포 대사를 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴적인 방법을 제공한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 대사는 세포가 에너지를 생성하는 과정이며, 암을 포함한 많은 질병은 비정상적인 신진 대사를 특징으로합니다. 환원된 니코틴아미드 아데닌(포스페이트) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)는 대사 반응의 조효소이다. NAD(P)H 및 FAD는 자가형광을 나타내며 여기 및 방출 파장에 의해 분광적으로 분리될 수 있다. 조효소인 NAD(P)H 및 FAD는 모두 유리 또는 단백질 결합 구성으로 존재할 수 있으며, 이들 각각은 형광단이 여기된 상태로 유지되는 시간인 뚜렷한 형광 수명을 갖는다. 형광 수명 이미징 (FLIM)은 세포 대사의 라벨없는 분석을 위해 NAD (P) H 및 FAD의 형광 강도와 수명을 정량화 할 수 있습니다. 형광 강도 및 수명 현미경은 적절한 여기 및 방출 파장을 선택하여 NAD(P)H 및 FAD 이미징에 최적화할 수 있습니다. 시안화물에 의한 대사 교란은 세포 내의 대사 변화를 검출하기 위해 자기 형광 이미징 프로토콜을 검증합니다. 이 기사에서는 세포 신진 대사를 측정하기위한 NAD (P) H 및 FAD의 자기 형광 이미징 기술을 시연합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신진 대사는 에너지를 생산하는 세포 과정입니다. 세포 대사는 글리코 분해, 산화 인산화 및 글루타미노분해를 포함한 여러 경로를 포함합니다. 건강한 세포는 면역 세포에 의한 사이토카인의 생산과 같은 증식 및 기능을위한 에너지를 생성하기 위해 이러한 대사 경로를 사용합니다. 대사 장애, 암 및 신경 변성을 포함한 많은 질병은 변경된 세포 대사를 특징으로합니다1. 예를 들어, 일부 암 세포 유형은 산소의 존재 하에서도 핵산, 단백질 및 지질의 합성을 위한 분자를 생성하기 위해 상승된 당분해 속도를 갖는다2,3. 바르부르크 효과로 알려진 이 현상은 유방암, 폐암, 교모세포종4을 포함한 많은 암 유형의 특징이다. 암 진행과 관련된 세포 대사의 변화로 인해, 세포 대사는 약물 반응에 대한 대리 바이오마커가 될 수 있다5,6. 더욱이, 세포 수준에서 약물 효능을 이해하는 것은 세포 이질성이 개인에서 상이한 약물 반응을 초래할 수 있기 때문에 중요하다7,8

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 이미징을위한 셀 도금

  1. MCF-7 세포의 80-90% 컨플루언트 T-75 플라스크로부터 배지를 흡인하고, 세포를 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 10 mL로 헹구고, 0.25% 트립신(1x) 2 mL를 첨가하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 분리한다.
  2. 플라스크를 ∼4분 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 분리를 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인하십시오.
  3. 즉시 배지 8 mL를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다.
  4. 세포를 원뿔형 튜브 (15 mL 또는 50 mL)에 수집하십시오. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오.
  5. 세포 200 × g 을 5분 동안 원심분리한다.
  6. 일단 원심분리되면, 상청액을 흡인한다. 세포의 펠렛을 1 mL의 배지에 재현탁시키고, 시드 4 × 105 세포를 35 mm 유리 바닥 이미징 접시 (또는 사용되는 현미경에 적합한 샘플 홀더) 상에 상에.
  7. 세포 대사를 유지하기 위해 이미징 접시에 2 mL의 배지를 첨가하십시오.
  8. 세포를 37°C에서 24-48시간 동안 5% CO2 와 함께 인큐베이션한 후 세포가 부착하고 대수 성장 단계에 도달하도록 이미징....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상피 유방암 세포주인 MCF-7을 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형광 이미징을 위해, 세포를 이미징 48 h 전에 35 mm 유리 바닥 이미징 디쉬 당 4 × 105 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 시안화물 처리 전후에 이미지화하였다. 시안화물 실험의 목표는 NAD(P)H 및 FAD 형광의 스펙트럼 분리를 확인하고 세포의 대사 변화를 검출하기 위한 이미징 시스템 및 분석 프로토콜을 검증하는 것입니다. 쌍을 이룬 NAD(P)H 및 FAD 형광 수명 이미지는 시안화물 이전의 다섯 개의 상이한 위치와 시안화물을 배지에 첨가한 후 다섯 개의 상이한 위치에서 촬영되었다. 형광 수명 파라미터(광학 산화환원 비, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1<.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자가 형광 강도 및 평생 이미징은 세포의 신진 대사를 평가하기 위해 널리 사용되어 왔습니다.21,55. FLIM은 고분해능이므로 단일 세포를 해결하는데, 이는 세포 이질성이 종양 공격성 및 약물 내성에 기여하기 때문에 암 연구에 중요합니다.7,39,41,44,45,46,58. 마찬가지로, 세포 대사의 자가형광 영상은 면역 세포 기능이 세포 대사와 연결되어 있고, 면역 세포 집단이 종종 이질적이기 때문에 면역 세포를.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

자금 출처에는 텍사스 암 예방 및 연구소 (CPRIT RP200668)와 텍사스 A & M 대학이 포함됩니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-deoxy-d-glucose (2-DG)시그마AC111980000; AC111980010; AC111980050;
항생제, 항균제(펜-스트렙),Gibco15240096
세포 샘플,미국형 배양 컬렉션해당 없음MCF-7 암 라인
, CellProfiler, Broad Institute해당 없음,이미지 분석 소프트웨어
원뿔형 튜브VWR89039-66415 mL 원뿔형 튜브
DMEMThermoFisher11965092배양 매체
FAD 이색성 거울SemrockFF495-Di03-25x36495 nm
FAD 방출 필터SemrockFF01-550/88-25550/88 nm
FAD 여기 필터SemrockFF01-458/64-25458/64 nm
FBSThermoFisher16000036
형광 수명 현미경3iN/A
유리 바닥 접시MatTek CorpP35G-1.0-14-C
다광자 레이저간섭성N/A2P 간섭성 레이저, 조정 가능한 680 nm-1080 nm
NAD(P)H 이색성 거울SemrockFF409-Di03-25x36409 nm
NAD(P)H 방출 필터SemrockFF02-447/60-25447/60 nm
NAD(P)H 여기 필터SemrockFF01-357/44-25357/44 nm
PBSThermoFisher70011044
시안화칼시그마-알드리치380970
슬라이드북 63iN/A이미지 수집 소프트웨어
SPCImageBecker & Hickl GmbHN/A형광 수명 분석 소프트웨어
스테이지 탑 인큐베이터okoLabN/A
TrypsinBiosciences786-262
UreaSigma-AldrichU5128
YG beadsPolysciences19096-2Yg 마이크로스피어 (20.0 µ m)
AC111980250, , , , , , , , 륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using en....

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