Summary
A avaliação clínica da espasticidade baseada no reflexo de Hoffmann (reflexo H) e utilizando a estimulação elétrica de nervos periféricos é um método estabelecido. Aqui, nós fornecemos um protocolo para uma estimulação nervosa terminal e direta para quantificação do reflexo H na pata dianteira de camundongos.
Abstract
O reflexo de Hoffmann (reflexo H), como análogo elétrico ao reflexo de estiramento, permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurais após lesões como lesão medular ou acidente vascular cerebral. Um aumento da resposta reflexa H, juntamente com sintomas como contrações musculares não voluntárias, reflexo de estiramento patologicamente aumentado e hipertonia no músculo correspondente, é um indicador de espasticidade pós-AVC (PSS).
Em contraste com medidas transcutâneas bastante inespecíficas do nervo, apresentamos aqui um protocolo para quantificar o reflexo-H diretamente nos nervos ulnar e mediano da pata anterior, que é aplicável, com pequenas modificações, ao nervo tibial e ciático da pata traseira. Baseado na estimulação direta e na adaptação a diferentes nervos, o método representa uma ferramenta confiável e versátil para validar mudanças eletrofisiológicas em modelos de doenças relacionadas à espasticidade.
Introduction
O reflexo de Hoffmann (reflexo H), nomeado em homenagem ao fisiologista Paul Hoffmann, pode ser evocado pela estimulação elétrica de nervos periféricos, que carregam axônios de neurônios sensoriais e motores que surgem e levam aos mesmos músculos. É o análogo eletricamente induzido do reflexo de estiramento monossináptico e compartilha a mesma via1. Diferentemente do alongamento muscular, o reflexo H resulta da estimulação elétrica. Quando os nervos periféricos são estimulados eletricamente em baixa intensidade de corrente, as fibras aferentes de Ia são tipicamente despolarizadas primeiro devido ao seu grande diâmetro axonal2. Seus potenciais de ação excitam neurônios motores alfa (αMNs) na medula espinhal, que por sua vez provocam potenciais de ação que viajam pelos axônios αMN em direção ao músculo (Figura 1). Essa cascata gera uma resposta muscular com pequena amplitude, refletida na chamada onda H. Ao aumentar gradualmente a intensidade do estímulo, a amplitude da onda H aumenta devido ao recrutamento de unidades motoras adicionais. A partir de uma certa intensidade de estímulo, potenciais de ação nos axônios mais finos dos αMNs são eliciados diretamente, o que é registrado como a onda M. Essa onda M aparece com latência menor que a onda H (Figura 2). Se a intensidade da estimulação é aumentada, a amplitude da onda M torna-se maior devido ao recrutamento de mais axônios αMN, enquanto a onda H gradualmente se torna menor. A onda H pode ser suprimida em altas intensidades de estímulo devido à retropropagação antidrômica dos potenciais de ação nos axônios αMN. Esses potenciais de ação desencadeados colidem com os da estimulação Ia e, assim, podem se anular. Em intensidades de estímulo supramáximas, os potenciais de ação ortodrômicos (em direção ao músculo) e antidrômicos (em direção à medula espinhal) ocorrem em todos os axônios do NM; o primeiro dá origem à amplitude máxima da onda M (Mmáx), enquanto o segundo resulta na completa abolição do reflexo H3.
Para a avaliação da espasticidade pós-AVE (ECP) ou lesão medular (LME), o reflexo H tem sido utilizado para avaliar a base neural do movimento e espasticidade emhumanos1. Uma melhor quantificação da mudança no reflexo H entre as medidas e entre os sujeitos é obtida usando a razão da onda H e M (relação H/M). Alternativamente, a depressão dependente da taxa (RDD) é medida, usando um conjunto de frequências ascendentes (por exemplo, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). A RDD reflete a integridade de circuitos inibitórios que podem ser perturbados por acidente vascular cerebral ou LME. Quando todos os circuitos neurais estão intactos, há uma supressão uniforme, independente da frequência, do reflexo-H. No entanto, se houver redução da inibição neural como resultado de AVC ou LME, a supressão do reflexo-H diminui com o aumento da frequência de estimulação4.
O correto registro eletrofisiológico utilizando eletrodos de superfície pode ser desafiador e pode ser afetado por tarefas motoras, mecanismos inibitórios e excitabilidade de αMN5. No registro transcutâneo em roedores, um eletrodo de estímulo é colocado próximo ao nervo tibial e um eletrodo de registro é colocado próximo aos músculos relacionados na pata anterior. De acordo com nossa experiência, entretanto, o correto posicionamento dos eletrodos transcutâneos (Figura 1A) é ainda mais complexo e variável em roedores do que o posicionamento de eletrodos de superfície em humanos. Isso pode levar a diferenças no comprimento, frequência e intensidade de estimulação necessários para eliciar o reflexo H. Esses desafios metodológicos poderiam explicar por que há apenas um número muito limitado de estudos de mensuração do reflexo H (por exemplo, em modelos experimentais deAVE3,4 e outros modelos de espasticidade6. Uma estimulação precisa (a longo prazo) e o registro do reflexo-H em nervos individuais poderiam, em princípio, ser obtidos usando eletrodos implantáveis ao redor do nervo alvo 7,8. Devido ao desafio cirúrgico com potenciais efeitos colaterais para o animal e potencial instabilidade da sonda, essa abordagem não se tornou um padrão na área. O método aqui apresentado também requer alguns conhecimentos cirúrgicos. No entanto, permite uma nova e precisa estimulação e registro de nervos isolados in vivo usando baixas intensidades de estimulação, o que evita a estimulação simultânea de nervos vizinhos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em contraste com as medidas transcutâneas do reflexo H previamente descritas emcamundongos6, fornecemos uma medida mais direta e específica do nervo. Essa nova abordagem pode ser aplicada aos nervos dos membros anteriores e posteriores (por exemplo, mediano, ulnar e radial, tibial e ciático, respectivamente), tornando esse método adaptável como ferramenta diagnóstica a muitos modelos de doenças (por exemplo, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio de T. Akay, da Dalhousie University, durante uma visita de MG ao seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Fundação Friebe (T0498/28960/16) e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.
Materials
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | – | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | – | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | – | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | – | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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