Osmotisk pumpbaserad läkemedelsleverans för In Vivo remyelinationsforskning om centrala nervsystemet

Summary

Demyelinisering sker i flera sjukdomar i centrala nervsystemet. En tillförlitlig in vivo drug delivery-teknik är nödvändig för remyeliniserande drogtestning. Detta protokoll beskriver en osmotisk pumpbaserad metod som möjliggör långvarig läkemedelsleverans direkt i hjärnparenkymet och förbättrar läkemedlets biotillgänglighet, med bred tillämpning inom remyelinationsforskning.

Abstract

Demyelinisering har identifierats i inte bara multipel skleros (MS), men också andra sjukdomar i centrala nervsystemet som Alzheimers sjukdom och autism. Eftersom bevis tyder på att remyelinisering effektivt kan förbättra sjukdomssymtomen, finns det ett ökande fokus på läkemedelsutveckling för att främja myelinregenereringsprocessen. Således krävs en regionvalbar och resultatpåförsörlig läkemedelsleveransteknik för att testa effektiviteten och specificiteten hos dessa läkemedel in vivo. Detta protokoll introducerar det osmotiska pumpimplantatet som en ny läkemedelsleveransmetod i den lysolecithininducerade demyeliniseringsmusmodellen. Den osmotiska pumpen är en liten implanterbar enhet som kan kringgå blod-hjärnbarriären (BBB) och leverera läkemedel stadigt och direkt till specifika områden i mushjärnan. Det kan också effektivt förbättra biotillgängligheten av läkemedel som peptider och proteiner med kort halveringstid. Därför är denna metod av stort värde för området för myelinregenereringsforskning i centrala nervsystemet.

Introduction

Den osmotiska pumpen är en liten implanterbar lösningsfrigörande anordning. Det kan användas för systemisk leverans när den implanteras subkutant eller i bukhålan. Ytan på den osmotiska pumpen är ett halvpermeabelt membran och dess inre sida är ett permeabelt skikt. Den osmotiska pumpen arbetar med hjälp av den osmotiska tryckskillnaden mellan det osmotiska skiktet och vävnadsmiljön där pumpen implanteras. Den höga osmolaliteten hos det osmotiska skiktet gör att vattnet i vävnaden strömmar in i det osmotiska skiktet genom det halvpermeabla membranet på pumpytan. Det osmotiska skiktet expanderar och komprimerar den flexibla behållaren inuti pumpen och förskjuter därigenom lösningen från den flexibla behållaren med en viss hastighet under lång tid¹. Pumpen har tre olika reservoarvolymer, 100 μL, 200 μL och 2 ml, med leveranshastigheter som varierar från 0,11 μL/h till 10 μL/h. Beroende på vald pumptyp kan enheten fungera från 1 dag till 6 veckor². I detta protokoll används en 100 μL osmotisk pump med en överföringshastighet på 0,25 μL /h som kan fungera i 14 dagar.

Redan på 1970-talet hade den osmotiska pumpen använts i neurovetenskaplig forskning ^3,4. Till exempel antog Wei et al. den osmotiska pumpmetoden för att injicera opioidpeptider i ventrikeln i en studie av narkotikamissbruk³. Efter kontinuerlig förbättring har den osmotiska pumpen nu använts i studien av kontrollerad leverans av tusentals läkemedel, inklusive peptider, tillväxtfaktorer, beroendeframkallande läkemedel, hormoner, steroider, antikroppar och så vidare. Dessutom, med speciella katetrar (Brain Infusion Kits) bifogade, kan den användas för riktad infusion till specifika vävnader eller organ, inklusive ryggmärgen, hjärnan, mjälten och levern ^5,6,7.

I studien av remyelinisering har många läkemedel visat sig främja myelinregenerering in vitro, men de flesta av dem har inte uppnått signifikanta effekter in vivo, möjligen på grund av bristen på en lämplig administreringsmetod. Traditionella administreringsmetoder såsom intraperitoneal injektion, subkutan injektion och intragastrisk administrering har begränsningar i läkemedlets biotillgänglighet. Dessutom har vissa läkemedel dålig permeabilitet för blod-hjärnbarriären, vilket undergräver deras tillgång till hjärnparenkym. Tillsammans kräver dessa begränsningar en ny effektiv leveransmetod. I kombination med hjärninfusionssatserna kan osmotiska pumpar kringgå blod-hjärnbarriären och leverera läkemedel direkt till corpus callosum, vilket effektivt förbättrar biotillgängligheten av läkemedel, särskilt för vissa polypeptid- och proteinläkemedel med kort halveringstid. Därför är den osmotiska pumpen som en ny drug delivery-teknik av stort värde för forskningen om myelinregenerering i centrala nervsystemet. Tillämpningen av denna teknik kommer att introduceras i detalj nedan.

Protocol

Alla djurförsök genomfördes enligt institutionella riktlinjer och protokoll som godkänts av djurskydds- och etikkommittén vid det tredje militära medicinska universitetet. 1. Upprättande av den lysolecithininducerade demyeliniseringsmusmodellen Förbered 1% lysolecithin (även kallad L-α-Lysophosphatidylcholine) lösning med steril PBS. Sterilisera sax, pincett, krökt hemostat och andra kirurgiska instrument genom autoklavsterilisering. Sterilisera…

Representative Results

För att verifiera effekten av den osmotiska pumpen i myelinregenereringsforskningen skapades en lysolecithininducerad demyeliniseringsmodell hos P56-möss, följt av implantation av osmotiska pumpar innehållande UM206 (1 mg i 1,5 ml 0,9% saltlösning), en peptid med kort halveringstid och dålig BBB-permeabilitet som nyligen har rapporterats främja remyelinering10 . 0,9% saltlösning användes som kontroll. Fjorton dagar efter modelletableringen perfusionerades möss transkardiellt med 4% forma…

Discussion

Detta protokoll beskriver den osmotiska pumpen som en ny läkemedelsleveransteknik för myelinregenereringsforskning, som kan leverera läkemedel direkt till behandlingsstället och möjliggöra konsekvent läkemedelsleverans under en längre period, vilket skapar en stabil läkemedelskoncentration i mikromiljön i centrala nervsystemet under hela experimenttiden. Jämfört med andra läkemedelsleveransmetoder bidrar den osmotiska pumpen mer till att upprätthålla läkemedelskoncentrationen i demyeliniseringsskadan<sup …

Materials

Anesthesia Air Pump	RWD	R510-29	E05818-006
Brain Infusion kit 3	ALZET	0008851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg every 24 h
Erythromycin eye ointment	Along technology	YCKJ-RJ-024780	Cover the surface of the eyeballs during anesthesia
Erythromycin ointment	pythonbio	RG180
Gas Evacuation Apparatus	RWD	R546W	E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholine	Sigma	L0906	Dissolve at 1% with sterile PBS
Microliter Syringe	Hamilton	65460-05	Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge
Micro-smotic pump model 1002	ALZET	0004317	0.25 µL per hour, 14 days
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodium	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia
Small Animal Anesthesia Machine	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaxic Equipment	RWD	E06382
STERI 250 sterilizer	Keller	31101	Rapid sterilization of surgical instruments
Surgical sutures	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Syringe needle (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 gauge (0.45 mm x 16 mm)
Testing drug and solvent	Experiment dependent	N/A
ThermoStar Homeothermic Monitoring System	RWD	69026	Maintain body temperature during anesthesia
Vetbond Tissue adhesive	3M	1469SB	Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision