גישה כירורגית סטריאוטקסית למיקרו-איניג'קט גזע המוח הקאודלי וחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ציסטרנה מגנה בעכברים
Summary
ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים כולל בדרך כלל גישה דרך עצמות הגולגולת ומונחה על ידי ציוני דרך בגולגולת. כאן אנו מתווים גישה סטריאוטקסית חלופית כדי להתמקד בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ה-cisterna magna המסתמך על הדמיה ישירה של ציוני דרך של גזע המוח.
Abstract
ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים מונחה בדרך כלל על ידי ציוני דרך של גולגולת. לאחר מכן מתקבלת הגישה באמצעות חורי בור שנקדחו דרך הגולגולת. גישה סטנדרטית זו יכולה להיות מאתגרת עבור מטרות בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון בשל אתגרים אנטומיים ספציפיים מכיוון שאתרים אלה מרוחקים מציוני דרך של גולגולת, מה שמוביל לחוסר דיוק. כאן אנו מתארים גישה סטריאוטקסית חלופית באמצעות ה-cisterna magna ששימשה כדי להתמקד באזורים בדידים בעלי עניין בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון. הציסטרנה מגנה משתרעת מהעצם העורפית ועד האטלס (כלומר, עצם החוליה השנייה), מלאה בנוזל מוחי, ומכוסה על ידי דורה מאטר. גישה זו מספקת נתיב גישה ניתן לשחזור למבנים נבחרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שאחרת קשה להגיע אליהם בשל מחסומים אנטומיים. יתר על כן, הוא מאפשר הדמיה ישירה של ציוני דרך בגזע המוח בסמיכות לאתרי המטרה, מה שמגדיל את הדיוק בעת אספקת נפחי הזרקה קטנים לאזורי עניין מוגבלים בגזע המוח הקאודלי ובחובר הצוואר העליון. לבסוף, גישה זו מספקת הזדמנות להימנע המוח הקטן, אשר יכול להיות חשוב עבור מחקרים מוטוריים וסנסו-מוטוריים.
Introduction
ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי לאיתור אתרי מוח בעכברים1 כולל בדרך כלל קיבוע של הגולגולת באמצעות סט של מוטות אוזניים ומוט פה. הקואורדינטות נאמדות לאחר מכן על סמך אטלסים ייחוס 2,3, ונקודות ציון של הגולגולת, כלומר, bregma (הנקודה שבה התפרים של העצמות המצחיות והקודקודיות מתאחדות) או למבדה (הנקודה שבה התפרים של העצמות הקודקודיות והאוציפיטליות מתאחדות; איור 1א,ב). דרך חור בור לתוך הגולגולת שמעל המטרה המשוערת, ניתן להגיע לאזור המטרה, בין אם לצורך אספקת מיקרו-אינטגרציות או מכשור עם צינוריות או סיבים אופטיים. בשל שונות באנטומיה של תפרים אלה וטעויות בלוקליזציה של bregma או lambda 4,5, המיקום של נקודות אפס ביחס למוח משתנה מחיה לחיה. בעוד שטעויות קטנות במיקוד, הנובעות מהשתנות זו, אינן מהוות בעיה עבור מטרות גדולות או קרובות, השפעתן גדולה יותר עבור אזורי עניין קטנים יותר המרוחקים מנקודות האפס במישורים האנטרופוסטריוריים או הגביים ו/או כאשר חוקרים בעלי חיים בגדלים משתנים בשל גיל, מתח ו/או מין. ישנם מספר אתגרים נוספים שהם ייחודיים למדולה אובלונגטה ולחוט הצוואר העליון. ראשית, שינויים קטנים בקואורדינטות אנטרופוסטריות קשורים לשינויים משמעותיים בקואורדינטות הגב-ונטרליות ביחס לדורה, בשל המיקום והצורה של המוח הקטן (איור 1Bi)2,6,7. שנית, חוט הצוואר העליון אינו כלול בתוך הגולגולת2. שלישית, תנוחת ההטיה של העצם העורפית והשכבה העליונה של שרירי הצוואר2 הופכת את הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית למאתגרת עוד יותר עבור מבנים הממוקמים בסמוך למעבר בין גזע המוח לחוט השדרה (איור 1Bi). לבסוף, מטרות רבות של עניין בגזע המוח הקאודלי ובחובר צוואר הרחם הן קטנות2, הדורשות זריקות מדויקות וניתנות לשחזור 8,9.
גישה חלופית באמצעות הציסטרנה מגנה עוקפת את הבעיות הללו. הציסטרנה מגנה היא חלל גדול המשתרע מהעצם העורפית ועד האטלס (איור 1A, כלומר עצם החוליה השנייה)10. הוא מלא בנוזל שדרתי ומכוסה על ידי דורה מאטר10. רווח זה בין העצם העורפית לבין האטלס נפתח בעת אנטרופלקסינג של הראש. ניתן לגשת אליו על ידי ניווט בין הבטן הזוגית העליונה של שריר הלונגוס קפיטיס, וחושף את פני השטח הגביים של גזע המוח הקאודלי. לאחר מכן ניתן להתמקד באזורים מעניינים על סמך ציוני הדרך של אזורים אלה עצמם אם הם ממוקמים בסמוך לפני השטח הגביים; או על ידי שימוש ב-obex, הנקודה שבה התעלה המרכזית נפתחת לחדר IV, כנקודת אפס לקואורדינטות כדי להגיע למבנים עמוקים יותר. גישה זו שימשה בהצלחה במגוון מינים, כולל חולדה11, חתול12, עכבר 8,9, ופרימט לא אנושי13 כדי להתמקד בקבוצת הנשימה הגחונית, היווצרות רשתית מדיאלית מדולרית, גרעין דרכי הבודדות, אזור פוסטרמה או גרעין היפוגלוסלי. עם זאת, גישה זו אינה נמצאת בשימוש נרחב מכיוון שהיא דורשת ידע באנטומיה, ערכת כלים מיוחדת וכישורים כירורגיים מתקדמים יותר בהשוואה לגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית.
כאן אנו מתארים גישה כירורגית שלב אחר שלב כדי להגיע לגזע המוח ולחוט הצוואר העליון דרך הציסטרנה מגנה, לדמיין ציוני דרך, להגדיר את נקודת האפס (איור 2), ולהעריך ולמטב את קואורדינטות המטרה להעברה סטריאוטקסית של מיקרו-איניג’מנטים לתוך גזע המוח הבדיד ואזורי העניין של חוט השדרה (איור 3). לאחר מכן נדון ביתרונות ובחסרונות הקשורים לגישה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי מסתמך בדרך כלל על ציוני דרך של גולגולת כדי לחשב את הקואורדינטות של אתרי המטרה ב- CNS1. לאחר מכן ניגשים לאתרי המטרה דרך חורי בור שנקדחים דרך הגולגולת1. שיטה זו אינה אידיאלית לגזע המוח הקאודלי, שכן אתרי המטרה ממוקמים הרחק מציוני הדרך של הג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי R01 NS079623, P01 HL149630 ו- P01 HL095491.
Materials
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
