Recursos bioinformáticos para el estudio de las interacciones de proteínas mediadas por glicanos
Summary
Este protocolo ilustra cómo explorar, comparar e interpretar los glicomas de proteínas humanas con recursos en línea.
Abstract
La iniciativa Glyco@Expasy se lanzó como una colección de bases de datos y herramientas interdependientes que abarcan varios aspectos del conocimiento en glicobiología. En particular, tiene como objetivo resaltar las interacciones entre las glicoproteínas (como los receptores de la superficie celular) y las proteínas de unión a carbohidratos mediadas por glicanos. Aquí, los principales recursos de la colección se presentan a través de dos ejemplos ilustrativos centrados en el N-glicoma del antígeno prostático específico (PSA) humano y el O-glicoma de las proteínas séricas humanas. A través de diferentes consultas de bases de datos y con la ayuda de herramientas de visualización, este artículo muestra cómo explorar y comparar contenido en un continuo para recopilar y correlacionar piezas de información dispersas. Los datos recopilados están destinados a alimentar escenarios más elaborados de la función del glicano. La glicoinformática introducida aquí se propone, por lo tanto, como un medio para fortalecer, dar forma o refutar las suposiciones sobre la especificidad de un glicoma proteico en un contexto dado.
Introduction
Los glicanos, proteínas a las que están unidos (glicoproteínas) y proteínas a las que se unen (lectinas o proteínas de unión a carbohidratos) son los principales actores moleculares en la superficie celular1. A pesar de este papel central en la comunicación célula-célula, los estudios a gran escala, incluidos los datos de glicómica, glicoproteómica o glicano-interactómica, siguen siendo escasos en comparación con su contraparte en genómica y proteómica.
Hasta hace poco, no se habían desarrollado métodos para caracterizar las estructuras ramificadas de los carbohidratos complejos sin dejar de conjugarse con la proteína portadora. La biosíntesis de glicoproteínas es un proceso no basado en plantillas en el que los donantes de monosacáridos, los sustratos de glicoproteínas que aceptan y las glicosiltransferasas y glucosidasas desempeñan un papel interactivo. Las glicoproteínas resultantes pueden soportar estructuras complejas con múltiples puntos de ramificación donde cada componente monosacárido puede ser uno de los varios tipos presentes en la naturaleza1. El proceso no basado en plantillas impone el análisis bioquímico como la única opción para generar datos estructurales de oligosacáridos. El proceso analítico de las estructuras de glicanos unidas a una proteína nativa a menudo es un desafío, ya que requiere tecnologías sensibles, cuantitativas y robustas para determinar la composición de monosacáridos, enlaces y secuencias de ramificación2.
En este contexto, la espectrometría de masas (EM) es la técnica más utilizada en experimentos de glucómica y glicoproteómica. A medida que pasa el tiempo, estos se llevan a cabo en configuraciones de mayor rendimiento y los datos ahora se acumulan en las bases de datos. Estructuras de glicanos en varios formatos3, rellenen GlyTouCan4, el repositorio universal de datos de glicanos donde cada estructura está asociada con un identificador estable independientemente del nivel de precisión con el que se defina el glicano (por ejemplo, posiblemente falta el tipo de enlace o la composición ambigua). Se recogen estructuras muy similares, pero sus pequeñas diferencias se informan claramente. Las glicoproteínas se describen y curan en GlyConnect5 y GlyGen6, dos bases de datos que se cruzan entre sí. Los datos de EM que respaldan las piezas estructurales de evidencia se almacenan cada vez más en GlycoPOST7. Para una cobertura más amplia de los recursos en línea, el capítulo 52 del manual de referencia, Essentials of Glycobiology, está dedicado a la glicoinformática8. Curiosamente, el software de identificación de glicopéptidos ha proliferado en los últimos años9,10 aunque no en beneficio de la reproducibilidad. Esta última preocupación llevó a los líderes de la Iniciativa de Glicoproteómica (HGI) de HUPO a establecer un desafío de software en 2019. Los datos de EM obtenidos del procesamiento de mezclas complejas de proteínas séricas humanas N- y O-glicosiladas en los modos de fragmentación CID, ETD y EThcD, se pusieron a disposición de los competidores, ya sean usuarios de software o desarrolladores. El informe completo sobre los resultados de este desafío11 solo se describe aquí. Para empezar, se observó una propagación de identificaciones. Se interpretó principalmente como causado por la diversidad de métodos implementados en los motores de búsqueda, de sus configuraciones y cómo se filtraron las salidas y se “contaron” los péptidos. El diseño experimental también puede haber puesto algunos software y enfoques en una (des)ventaja. Es importante destacar que los participantes que usaron el mismo software informaron resultados inconsistentes, destacando así graves problemas de reproducibilidad. Se concluyó comparando diferentes presentaciones que algunas soluciones de software funcionan mejor que otras y algunas estrategias de búsqueda producen mejores resultados. Es probable que esta retroalimentación guíe la mejora de los métodos automatizados de análisis de datos de glicopéptidos y, a su vez, afecte el contenido de la base de datos.
La expansión de la glicoinformática llevó a la creación de portales web que proporcionan información y acceso a múltiples recursos similares o complementarios. Los más recientes y actualizados se describen en un capítulo de la serie de libros Comprehensive Glycoscience12 y, a través de la cooperación, se ofrece una solución para el intercambio de datos y la información en un modo de acceso abierto. Se desarrolló uno de estos portales, que originalmente se llamó Glycomics@ExPASy 13 y pasó a llamarse Glyco@Expasy, tras la importante revisión de la plataforma Expasy14 que ha alojado una gran colección de herramientas y bases de datos utilizadas en varias ómicas durante décadas, siendo el elemento más popular UniProt15, la base de conocimiento universal de proteínas. Glyco@Expasy ofrece un descubrimiento didáctico del propósito y uso de bases de datos y herramientas, basado en una categorización visual y una visualización de sus interdependencias. El siguiente protocolo ilustra los procedimientos para explorar datos de glicómica y glicoproteómica con una selección de recursos de este portal que hace explícita la conexión entre la glicoproteómica y la glicano-interactómica a través de la glucómica. Tal como están las cosas, los experimentos glucómicos producen estructuras donde los monosacáridos están completamente definidos y los enlaces parcial o totalmente determinados, pero su unión al sitio de la proteína está mal caracterizada, si es que lo está. Por el contrario, los experimentos de glicoproteómica generan información precisa de unión al sitio, pero con una resolución deficiente de las estructuras de glicanos, a menudo limitadas a composiciones de monosacáridos. Esta información se reúne en la base de datos GlyConnect. Además, las herramientas de búsqueda en GlyConnect se pueden utilizar para detectar posibles ligandos de glicanos que se describen junto con las proteínas que los reconocen en UniLectin16, vinculados a GlyConnect a través de glicanos. El protocolo presentado aquí se divide en dos secciones para cubrir preguntas específicas de los glicanos y glicoproteínas ligados a N y O.
Protocol
Representative Results
Discussion
GlyConnect Octopus como herramienta para revelar correlaciones inesperadas
GlyConnect Octopus fue diseñado originalmente para consultar la base de datos con una definición suelta de glicanos. De hecho, la literatura a menudo informa de las principales características de los glicanos en un glicoma, como ser fucosilado o sialilado, estar hecho de dos o más antenas, etc. Además, los glicanos, ya sean N u O, enlazados se clasifican en núcleos, como se detalla en el manual de referencia Essentials<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor reconoce calurosamente a los miembros pasados y presentes del Grupo de Informática Proteome involucrados en el desarrollo de los recursos utilizados en este tutorial, específicamente, Julien Mariethoz y Catherine Hayes para GlyConnect, François Bonnardel para UniLectin, Davide Alocci y Frederic Nikitin para Octopus, y Thibault Robin para Compozitor y el toque final sobre Octopus.
El desarrollo del proyecto glyco@Expasy cuenta con el apoyo del Gobierno Federal Suizo a través de la Secretaría de Estado de Educación, Investigación e Innovación (SERI) y actualmente se complementa con la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF: 31003A_179249). ExPASy es mantenido por el Instituto Suizo de Bioinformática y alojado en el Centro de Competencias Vital-IT. El autor también reconoce a Anne Imberty por su destacada cooperación en la plataforma UniLectin apoyada conjuntamente por ANR PIA Glyco@Alps (ANR-15-IDEX-02), Alliance Campus Rhodanien Co-funds (http://campusrhodanien.unige-cofunds.ch) Labex Arcane/CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003).
Materials
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