Bioinformatik-Ressourcen zur Untersuchung von Glykan-vermittelten Proteininteraktionen

Summary

Dieses Protokoll veranschaulicht, wie man menschliche Proteinglycomes mit Online-Ressourcen erforscht, vergleicht und interpretiert.

Abstract

Die Glyco@Expasy Initiative wurde als eine Sammlung von voneinander abhängigen Datenbanken und Werkzeugen ins Leben gerufen, die verschiedene Aspekte des Wissens in der Glykobiologie abdecken. Insbesondere zielt es darauf ab, Wechselwirkungen zwischen Glykoproteinen (wie Zelloberflächenrezeptoren) und kohlenhydratbindenden Proteinen, die durch Glykane vermittelt werden, hervorzuheben. Hier werden die wichtigsten Ressourcen der Sammlung anhand von zwei illustrativen Beispielen vorgestellt, die sich auf das N-Glycome des menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA) und das O-Glycome menschlicher Serumproteine konzentrieren. Durch verschiedene Datenbankabfragen und mit Hilfe von Visualisierungswerkzeugen zeigt dieser Artikel, wie man Inhalte in einem Kontinuum erforscht und vergleicht, um ansonsten verstreute Informationen zu sammeln und zu korrelieren. Die gesammelten Daten sind dazu bestimmt, ausgefeiltere Szenarien der Glykanfunktion zu füttern. Die hier eingeführte Glycoinformatics wird daher als Mittel vorgeschlagen, um Annahmen über die Spezifität eines Proteinglykoms in einem bestimmten Kontext entweder zu stärken, zu formen oder zu widerlegen.

Introduction

Glykane, Proteine, an die sie gebunden sind (Glykoproteine) und Proteine, an die sie binden (Lektine oder kohlenhydratbindende Proteine), sind die wichtigsten molekularen Akteure an der ^{Zelloberfläche1.} Trotz dieser zentralen Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation sind groß angelegte Studien, einschließlich Glykomik, Glykoproteomik oder Glykan-Interactomie-Daten, im Vergleich zu ihrem Gegenstück in der Genomik und Proteomik immer noch knapp.

Bis vor kurzem wurden keine Methoden entwickelt, um die Verzweigungsstrukturen komplexer Kohlenhydrate zu charakterisieren, während sie noch mit dem Trägerprotein konjugiert sind. Die Biosynthese von Glykoproteinen ist ein nicht vorlagengetriebener Prozess, bei dem die Monosaccharidspender, die akzeptierenden Glykoproteinsubstrate sowie die Glykosyltransferasen und Glykosidasen eine interaktive Rolle spielen. Die resultierenden Glykoproteine können komplexe Strukturen mit mehreren Verzweigungspunkten tragen, wobei jede Monosaccharidkomponente eine der verschiedenen in der Natur vorkommenden Typen sein ^kann1. Der nicht vorlagengesteuerte Prozess erzwingt die biochemische Analyse als einzige Möglichkeit zur Generierung von Oligosaccharid-Strukturdaten. Der analytische Prozess von Glykanstrukturen, die an ein natives Protein gebunden sind, ist oft eine Herausforderung, da er empfindliche, quantitative und robuste Technologien zur Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung, -verknüpfungen und -verzweigungssequenzen ^erfordert2.

In diesem Zusammenhang ist die Massenspektrometrie (MS) die am weitesten verbreitete Technik in Glykomik- und Glykoproteomik-Experimenten. Im Laufe der Zeit werden diese in höheren Durchsatzeinstellungen durchgeführt und Daten sammeln sich nun in Datenbanken an. Glykanstrukturen in verschiedenen ^Formaten3, füllen GlyTouCan4, das universelle Glykan-Datenrepository, in dem jede Struktur mit einem stabilen Identifikator verknüpft ist, unabhängig von der Genauigkeit, mit der das Glykan definiert ist (z. B. möglicherweise fehlender Verknüpfungstyp oder mehrdeutige Zusammensetzung). Sehr ähnliche Strukturen werden gesammelt, aber ihre geringfügigen Unterschiede werden deutlich berichtet. Glykoproteine werden in ^GlyConnect5 und GlyGen6 beschrieben und kuratiert, zwei Datenbanken, die sich gegenseitig referenzieren. MS-Daten, die strukturelle Beweismittel unterstützen^, werden zunehmend in GlycoPOST7 gespeichert. Für eine breitere Abdeckung von Online-Ressourcen ist Kapitel 52 des Referenzhandbuchs Essentials of Glycobiology der Glykoinformatik8 gewidmet. Interessanterweise hat sich die Glykopeptid-Identifizierungssoftware in den letzten Jahren stark ausgebreitet9,10^, wenn auch nicht zum Vorteil der Reproduzierbarkeit^. Die letztgenannte Sorge veranlasste die Leiter der HUPO GlycoProteomics Initiative (HGI), 2019 eine Software-Herausforderung zu stellen. Die MS-Daten, die aus der Verarbeitung komplexer Mischungen von N- und O-glykosylierten humanen Serumproteinen in CID-, ETD- und EThcD-Fragmentierungsmodi gewonnen wurden, wurden Wettbewerbern, ob Softwareanwendern oder Entwicklern, zur Verfügung gestellt. Der vollständige Bericht über die Ergebnisse dieser ^{Herausforderung11} wird hier nur skizziert. Zunächst wurde eine Ausbreitung von Identifikationen beobachtet. Es wurde hauptsächlich so interpretiert, dass es durch die Vielfalt der in Suchmaschinen implementierten Methoden, ihrer Einstellungen und der Art und Weise, wie Ausgaben gefiltert und Peptide “gezählt” wurden, verursacht wurde. Das experimentelle Design könnte auch einige Software und Ansätze in einen (Nachteil) gebracht haben. Wichtig ist, dass Teilnehmer, die dieselbe Software verwendeten, inkonsistente Ergebnisse meldeten und dadurch schwerwiegende Reproduzierbarkeitsprobleme hervorhoben. Durch den Vergleich verschiedener Einreichungen wurde festgestellt, dass einige Softwarelösungen besser abschneiden als andere und einige Suchstrategien bessere Ergebnisse liefern. Dieses Feedback wird wahrscheinlich zur Verbesserung automatisierter Glykopeptid-Datenanalysemethoden führen und sich wiederum auf den Datenbankinhalt auswirken.

Die Expansion der Glykoinformatik führte zur Schaffung von Webportalen, die Informationen und Zugang zu mehreren ähnlichen oder sich ergänzenden Ressourcen bieten. Die neuesten und aktuellsten werden in einem Kapitel der Comprehensive Glycoscience ^Buchreihe12 beschrieben und durch die Zusammenarbeit wird eine Lösung für den Datenaustausch und Informationsaustausch im Open-Access-Modus angeboten. Ein solches Portal wurde entwickelt, das ursprünglich ^{Glycomics@ExPASy 13} hieß und in Glyco@Expasy umbenannt wurde, nach der Generalüberholung der Expasy-Plattform14, die seit Jahrzehnten eine große Sammlung von Tools und Datenbanken beherbergt, die in mehreren -omics verwendet werden, wobei das beliebteste Element ^UniProt15 ist – die universelle Protein-Wissensdatenbank^. Glyco@Expasy bietet eine didaktische Entdeckung des Zwecks und der Nutzung von Datenbanken und Werkzeugen, basierend auf einer visuellen Kategorisierung und einer Darstellung ihrer Interdependenzen. Das folgende Protokoll veranschaulicht Verfahren zum Untersuchen von Glykomik- und Glykoproteomik-Daten mit einer Auswahl von Ressourcen aus diesem Portal, die die Verbindung zwischen Glykoproteomik und Glykan-Interactomics über Glykomik explizit machen. So wie es ist, erzeugen Glykomik-Experimente Strukturen, in denen Monosaccharide vollständig definiert und Verknüpfungen teilweise oder vollständig bestimmt sind, aber ihre Protein-Site-Bindung ist schlecht, wenn überhaupt, charakterisiert. Im Gegensatz dazu erzeugen Glykoproteomik-Experimente präzise Standortbindungsinformationen, jedoch mit einer schlechten Auflösung von Glykanstrukturen, die oft auf Monosaccharidzusammensetzungen beschränkt sind. Diese Informationen werden in der GlyConnect-Datenbank zusammengefasst. Darüber hinaus können Suchwerkzeuge in GlyConnect verwendet werden, um potenzielle Glykanliganden aufzuspüren, die zusammen mit den Proteinen, die sie in UniLectin16 erkennen, beschrieben werden, die über Glykane mit GlyConnect verbunden sind. Das hier vorgestellte Protokoll ist in zwei Abschnitte unterteilt, um spezifische Fragen zu N-verknüpften und O-verknüpften Glykanen und Glykoproteinen zu behandeln.

Protocol

HINWEIS: Ein Gerät mit einer Internetverbindung (größerer Bildschirm bevorzugt) und einem aktuellen Webbrowser wie Chrome oder Firefox ist erforderlich. Die Verwendung von Safari oder Edge ist möglicherweise nicht so zuverlässig. 1. Von einem Protein-N-Glycome in GlyConnect zu einem Lektin von UniLectin Zugreifen auf Ressourcen von Glyco@Expasy ausHINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren ist der Zugriff auf GlyConnect, kann jedoch auf den Zu…

Representative Results

Der erste Teil des Protokolls (Abschnitt 1) zeigte, wie die Spezifität oder die Gemeinsamkeit von N-Glykanen, die an Asn-69 des humanen Prostata-spezifischen Antigens (PSA) gebunden sind, mithilfe der GlyConnect-Plattform untersucht werden kann. Gewebeabhängige (Urin und Samenflüssigkeit) sowie isoformabhängige (normale und hohe pI) Variationen in der Glykanexpression wurden mit zwei Visualisierungswerkzeugen hervorgehoben (Abbildung 4 und Abbildung …

Discussion

GlyConnect Octopus als Werkzeug zur Aufdeckung unerwarteter Korrelationen
GlyConnect Octopus wurde ursprünglich entwickelt, um die Datenbank mit einer losen Definition von Glykanen abzufragen. In der Tat berichtet die Literatur oft über die Hauptmerkmale von Glykanen in einem Glykom, wie z.B. fucosyliert oder sialyliert, aus zwei oder mehr Antennen bestehend usw. Darüber hinaus werden Glykane, ob N- oder O-verknüpft, in Kerne eingeteilt, wie im Referenzhandbuch Essentials of ^Glyc…

Materials

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