クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー
Summary
この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3) を効果的に利用して、高解像度の構造決定のためのさまざまな単一粒子データセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。
Abstract
計測と画像処理ソフトウェアの両方の最近の進歩により、単一粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)は、構造生物学者が多種多様な巨大分子の高解像度構造を決定するための好ましい方法となっています。画像処理と構造計算のための複数のソフトウェアスイートが新規および専門家のユーザーが利用でき、顕微鏡検出器によって取得された映画はビーム誘起運動およびコントラスト伝達関数(CTF)推定の補正を受けるという同じ基本的なワークフローを合理化します。次に、反復的な 2D および 3D 分類のために、平均化されたムービー フレームからパーティクル イメージが選択されて抽出され、その後、3D 再構成、改良、および検証が行われます。さまざまなソフトウェア パッケージが異なるアルゴリズムを採用し、操作にさまざまなレベルの専門知識を必要とするため、生成される 3D マップの品質と解像度が異なることがよくあります。したがって、ユーザーは最適な結果を得るために、さまざまなプログラム間で定期的にデータを転送します。このホワイトペーパーでは、一般的なソフトウェアパッケージである cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3 を横断してワークフローをナビゲートし、アデノ随伴ウイルス (AAV) のほぼ原子分解能構造を取得するためのガイドを提供します。まず、cryoSPARC v3 を使用した画像処理パイプラインの詳細を説明します。これは、その効率的なアルゴリズムと使いやすい GUI により、ユーザーが 3D マップにすばやく到達できるためです。次のステップでは、PyEMと社内スクリプトを使用して、cryoSPARC v3で得られた最高品質の3D再構成からRELION-3およびScipion 3に粒子座標を変換および転送し、3Dマップを再計算します。最後に、RELION-3とScipion 3のアルゴリズムを統合することによって、結果の構造をさらに洗練し検証するための手順を概説します。この記事では、3つの処理プラットフォームを効果的に活用して、高解像度の構造決定のためにさまざまなデータセットに適用可能な単一の堅牢なワークフローを作成する方法について説明します。
Introduction
クライオ電子顕微鏡(クライオEM)および単粒子分析(SPA)は、水和状態の多種多様な生体分子集合体の構造決定を可能にし、これらの巨大分子の役割を原子で詳細に明らかにするのに役立ちます。顕微鏡光学系、コンピュータハードウェア、および画像処理ソフトウェアの改善により、2 Å1、2、3を超える解像度で生体分子の構造を決定することが可能になりました。2014年の192の構造と比較して、2020年には2,300以上のクライオEM構造がタンパク質データバンク(PDB)に寄託され4、クライオEMが多くの構造生物学者にとって選択の方法となっていることを示しています。ここでは、高解像度の構造決定のために3つの異なるSPAプログラムを組み合わせたワークフローについて説明します(図1)。
SPAの目標は、顕微鏡検出器によって記録されたノイズの多い2D画像から、ターゲット試料の3Dボリュームを再構築することです。検出器は、同じ視野の個々のフレームを持つムービーとして画像を収集します。サンプルを保存するために、フレームは低い電子線量で収集されるため、信号対雑音比(SNR)が低くなります。さらに、電子露光はガラス化クライオEMグリッド内で動きを誘発し、画像のぼやけをもたらす可能性がある。これらの問題を克服するために、フレームはビーム誘発運動を補正するように整列され、SNRが増加した顕微鏡写真が得られるように平均化される。これらの顕微鏡写真は、顕微鏡によって課される焦点ずれおよび収差の影響を説明するために、コントラスト伝達関数(CTF)推定を受ける。CTF補正顕微鏡写真から、個々の粒子が選択され、抽出され、ガラス質氷中の標本によって採用された異なる配向を表す2Dクラス平均にソートされる。得られた均質なパーティクルのセットは、 ab initio 3D再構成の入力として使用され、粗いモデルが生成され、その後、反復的に洗練されて1つ以上の高解像度構造が生成されます。再構成後、クライオEMマップの品質と解像度をさらに向上させるために、構造的な改良が行われます。最後に、原子モデルがマップから直接派生するか、マップが他の場所で得られた原子座標に適合されます。
Appion5、cisTEM6、cryoSPARC7、EMAN8、IMAGIC9、RELION10、Scipion11、SPIDER12、Xmipp13など、上記で概説したタスクを実行するためのさまざまなソフトウェアパッケージが利用可能です。これらのプログラムは同様の処理手順に従いますが、パーティクルの選択、初期モデルの生成、再構成の改良など、さまざまなアルゴリズムを採用しています。さらに、これらのプログラムは、新しいユーザーのハードルとして機能する可能性のあるパラメータの微調整に依存するものもあるため、動作するためにさまざまなレベルのユーザー知識と介入を必要とします。これらの不一致により、プラットフォーム間で一貫性のない品質と解像度のマップが生成されることが多く14、多くの研究者は複数のソフトウェアパッケージを使用して結果を改良および検証する必要があります。この記事では、クライオスパークv3、RELION-3、およびScipion 3を使用して、遺伝子治療に広く使用されているベクターであるAAVの高解像度3D再構成を得ることを強調します15。上記のソフトウェアパッケージは、アカデミックユーザーには無料です。cryoSPARC v3 および Scipion 3 にはライセンスが必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、さまざまなソフトウェアプラットフォーム間でクライオEMデータ処理を行い、高解像度の3D再構成を実現するための堅牢なSPAワークフローを紹介します(図1)。このワークフローは、多種多様な生物学的巨大分子に適用可能である。プロトコルの後続のステップは、ムービーの前処理、パーティクルのピッキングと分類、および構造の微細化(表…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Scipion3のインストールに協力してくれたCarlos Oscar Sorzano氏と、異なる処理プラットフォーム間のデータ転送を支援してくれたKilian Schnelle氏とArne Moeller氏に感謝します。この研究の一部は、NIH助成金U24GM129547によって支援され、OHSUのPNCCで実施され、生物環境研究局が後援するDOE科学局ユーザー施設であるEMSL(grid.436923.9)を介してアクセスされました。この研究は、ラトガース大学からアレク・クルチクへのスタートアップ助成金によって支援されました。
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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