Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion
Summary
Dieser Artikel beschreibt, wie drei Kryo-EM-Verarbeitungsplattformen, d. h. cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, effektiv genutzt werden können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Einzelpartikeldatensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.
Abstract
Jüngste Fortschritte sowohl in der Instrumentierung als auch in der Bildverarbeitungssoftware haben die Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zur bevorzugten Methode für Strukturbiologen gemacht, um hochauflösende Strukturen einer Vielzahl von Makromolekülen zu bestimmen. Für die Bildverarbeitung und Strukturberechnung stehen neue und erfahrene Benutzer mehrere Software-Suiten zur Verfügung, die den gleichen grundlegenden Workflow rationalisieren: Filme, die von den Mikroskopdetektoren aufgenommen wurden, werden für die Schätzung der strahleninduzierten Bewegung und der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) korrigiert. Als nächstes werden Partikelbilder ausgewählt und aus gemittelten Filmbildern für die iterative 2D- und 3D-Klassifizierung extrahiert, gefolgt von 3D-Rekonstruktion, Verfeinerung und Validierung. Da verschiedene Softwarepakete unterschiedliche Algorithmen verwenden und unterschiedliche Fachkenntnisse erfordern, unterscheiden sich die von ihnen generierten 3D-Karten häufig in Qualität und Auflösung. So übertragen Benutzer regelmäßig Daten zwischen einer Vielzahl von Programmen für optimale Ergebnisse. Dieses Dokument bietet eine Anleitung für Benutzer zum Navigieren in einem Workflow durch die gängigen Softwarepakete: cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3, um eine nahezu atomare Auflösungsstruktur des Adeno-assoziierten Virus (AAV) zu erhalten. Wir haben zunächst eine Bildverarbeitungspipeline mit cryoSPARC v3 detailliert beschrieben, da die effizienten Algorithmen und die benutzerfreundliche GUI es den Benutzern ermöglichen, schnell zu einer 3D-Karte zu gelangen. Im nächsten Schritt verwenden wir PyEM und interne Skripte, um Partikelkoordinaten von der besten 3D-Rekonstruktion in cryoSPARC v3 zu RELION-3 und Scipion 3 zu konvertieren und zu übertragen und 3D-Karten neu zu berechnen. Schließlich skizzieren wir Schritte zur weiteren Verfeinerung und Validierung der resultierenden Strukturen durch die Integration von Algorithmen aus RELION-3 und Scipion 3. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie drei Verarbeitungsplattformen effektiv nutzen können, um einen einzigen und robusten Workflow zu erstellen, der auf eine Vielzahl von Datensätzen für die hochauflösende Strukturbestimmung anwendbar ist.
Introduction
Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglichen die Strukturbestimmung einer Vielzahl von biomolekularen Baugruppen in ihrem hydratisierten Zustand und helfen, die Rolle dieser Makromoleküle im atomaren Detail zu beleuchten. Verbesserungen in der Mikroskopoptik, Computerhardware und Bildverarbeitungssoftware haben es ermöglicht, Strukturen von Biomolekülen mit einer Auflösung von mehr als 2 Å 1,2,3 zu bestimmen. Mehr als 2.300 Kryo-EM-Strukturen wurden 2020 in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegt, verglichen mit 192 Strukturen im Jahr 20144, was darauf hindeutet, dass Kryo-EM für viele Strukturbiologen zur Methode der Wahl geworden ist. Hier beschreiben wir einen Workflow, der drei verschiedene SPA-Programme zur hochauflösenden Strukturfindung kombiniert (Abbildung 1).
Das Ziel von SPA ist es, 3D-Volumina einer Zielprobe aus verrauschten 2D-Bildern zu rekonstruieren, die von einem Mikroskopdetektor aufgenommen wurden. Detektoren sammeln Bilder als Filme mit einzelnen Bildern des gleichen Sichtfeldes. Um die Probe zu erhalten, werden Frames mit einer niedrigen Elektronendosis gesammelt und haben somit ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Darüber hinaus kann die Elektronenbelichtung eine Bewegung innerhalb der verglasten Kryo-EM-Gitter induzieren, was zu Bildunschärfe führt. Um diese Probleme zu überwinden, werden die Rahmen so ausgerichtet, dass sie die strahleninduzierte Bewegung korrigieren, und gemittelt, um eine Mikroaufnahme mit einem erhöhten SNR zu erhalten. Diese Mikroaufnahmen werden dann einer CTF-Schätzung (Contrast Transfer Function) unterzogen, um die Auswirkungen von Defokus und Aberrationen, die vom Mikroskop auferlegt werden, zu berücksichtigen. Aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen werden einzelne Partikel ausgewählt, extrahiert und in 2D-Klassendurchschnitte sortiert, die unterschiedliche Orientierungen der Probe in Glaseis darstellen. Der resultierende homogene Satz von Partikeln wird als Input für die ab initio 3D-Rekonstruktion verwendet, um ein grobes Modell oder Modelle zu erzeugen, die dann iterativ verfeinert werden, um eine oder mehrere hochauflösende Strukturen zu erzeugen. Nach der Rekonstruktion werden strukturelle Verfeinerungen durchgeführt, um die Qualität und Auflösung der Kryo-EM-Karte weiter zu verbessern. Schließlich wird entweder ein Atommodell direkt von der Karte abgeleitet, oder die Karte ist mit atomaren Koordinaten ausgestattet, die an anderer Stelle erhalten wurden.
Verschiedene Softwarepakete sind verfügbar, um die oben beschriebenen Aufgaben zu erfüllen, einschließlich Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 und andere. Während diese Programme ähnlichen Verarbeitungsschritten folgen, verwenden sie verschiedene Algorithmen, um beispielsweise Partikel auszuwählen, anfängliche Modelle zu generieren und Rekonstruktionen zu verfeinern. Darüber hinaus erfordern diese Programme ein unterschiedliches Maß an Benutzerwissen und Eingriffen, da einige von der Feinabstimmung von Parametern abhängen, die als Hürde für neue Benutzer dienen können. Diese Diskrepanzen führen oft zu Karten mit inkonsistenter Qualität und Auflösung auf allen Plattformen14, was viele Forscher dazu veranlasst, mehrere Softwarepakete zu verwenden, um die Ergebnisse zu verfeinern und zu validieren. In diesem Artikel heben wir die Verwendung von cryoSPARC v3, RELION-3 und Scipion 3 hervor, um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion von AAV, einem weit verbreiteten Vektor für die Gentherapie15, zu erhalten. Die oben genannten Softwarepakete sind für akademische Benutzer kostenlos; cryoSPARC v3 und Scipion 3 benötigen Lizenzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel stellen wir einen robusten SPA-Workflow für die Kryo-EM-Datenverarbeitung über verschiedene Softwareplattformen hinweg vor, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen (Abbildung 1). Dieser Workflow ist auf eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen anwendbar. Die nachfolgenden Schritte des Protokolls sind in Abbildung 4 dargestellt, einschließlich Filmvorverarbeitung, Partikelkommissionierung und -klassifizierung sowie mehrerer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Carlos Oscar Sorzano für die Hilfe bei der Installation von Scipion3 und Kilian Schnelle und Arne Moeller für die Hilfe beim Datentransfer zwischen verschiedenen Verarbeitungsplattformen. Ein Teil dieser Forschung wurde durch den NIH-Zuschuss U24GM129547 unterstützt und am PNCC an der OHSU durchgeführt und über EMSL (grid.436923.9), eine vom Office of Biological and Environmental Research gesponserte DOE Office of Science User Facility, zugänglich gemacht. Diese Studie wurde durch ein Start-up-Stipendium der Rutgers University an Arek Kulczyk unterstützt.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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