Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion
Summary
Den här artikeln beskriver hur man effektivt använder tre kryo-EM-bearbetningsplattformar, dvs. cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3, för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika enpartikeldatauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.
Abstract
Nya framsteg inom både instrumentering och bildbehandlingsprogramvara har gjort kryoelektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) till den föredragna metoden för strukturbiologer att bestämma högupplösta strukturer av en mängd olika makromolekyler. Flera programvarusviter är tillgängliga för nya och expertanvändare för bildbehandling och strukturberäkning, vilket effektiviserar samma grundläggande arbetsflöde: filmer som förvärvas av mikroskopdetektorerna genomgår korrigering för uppskattning av strålinducerad rörelse och kontrastöverföringsfunktion (CTF). Därefter väljs partikelbilder och extraheras från genomsnittliga filmramar för iterativ 2D- och 3D-klassificering, följt av 3D-rekonstruktion, förfining och validering. Eftersom olika mjukvarupaket använder olika algoritmer och kräver olika kompetensnivåer för att fungera, skiljer sig de 3D-kartor de genererar ofta i kvalitet och upplösning. Således överför användare regelbundet data mellan en mängd olika program för optimala resultat. Detta dokument ger en guide för användare att navigera i ett arbetsflöde över de populära mjukvarupaketen: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en nära atomupplösningsstruktur för det adenoassocierade viruset (AAV). Vi beskriver först en bildbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, eftersom dess effektiva algoritmer och lättanvända GUI gör det möjligt för användare att snabbt komma fram till en 3D-karta. I nästa steg använder vi PyEM och interna skript för att konvertera och överföra partikelkoordinater från 3D-rekonstruktion av bästa kvalitet som erhållits i cryoSPARC v3 till RELION-3 och Scipion 3 och beräkna om 3D-kartor. Slutligen beskriver vi steg för ytterligare förfining och validering av de resulterande strukturerna genom att integrera algoritmer från RELION-3 och Scipion 3. I den här artikeln beskriver vi hur du effektivt använder tre bearbetningsplattformar för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika datauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.
Introduction
Kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) och enpartikelanalys (SPA) möjliggör strukturbestämning av en mängd olika biomolekylära sammansättningar i deras hydratiserade tillstånd, vilket hjälper till att belysa dessa makromolekylers roller i atomdetaljer. Förbättringar av mikroskopoptik, datorhårdvara och bildbehandlingsprogramvara har gjort det möjligt att bestämma strukturer för biomolekyler med upplösning som når bortom 2 Å1,2,3. Mer än 2 300 kryo-EM-strukturer deponerades i Protein Data Bank (PDB) 2020, jämfört med 192 strukturer 20144, vilket indikerar att kryo-EM har blivit den valda metoden för många strukturbiologer. Här beskriver vi ett arbetsflöde som kombinerar tre olika SPA-program för högupplöst strukturbestämning (Figur 1).
Målet med SPA är att rekonstruera 3D-volymer av ett målprov från bullriga 2D-bilder som spelats in av en mikroskopdetektor. Detektorer samlar in bilder som filmer med enskilda bildrutor med samma synfält. För att bevara provet samlas ramar in med en låg elektrondos och har därmed ett dåligt signal-brusförhållande (SNR). Dessutom kan elektronexponering inducera rörelse inom de förglasade kryo-EM-rutnäten, vilket resulterar i bildsuddning. För att övervinna dessa problem justeras ramarna för att korrigera för strålinducerad rörelse och i genomsnitt för att ge en mikrograf med en ökad SNR. Dessa mikrografer genomgår sedan uppskattning av kontrastöverföringsfunktionen (CTF) för att ta hänsyn till effekterna av defokus och avvikelser som mikroskopet påför. Från de CTF-korrigerade mikrograferna väljs, extraheras och sorteras enskilda partiklar i 2D-klassmedelvärde som representerar olika orienteringar som antas av provet i glasis. Den resulterande homogena uppsättningen partiklar används som ingång för ab initio 3D-rekonstruktion för att generera en grov modell eller modeller, som sedan iterativt förfinas för att producera en eller flera högupplösta strukturer. Efter rekonstruktion utförs strukturella förfiningar för att ytterligare förbättra kryo-EM-kartans kvalitet och upplösning. Slutligen är antingen en atommodell direkt härledd från kartan, eller kartan är utrustad med atomkoordinater som erhållits någon annanstans.
Olika mjukvarupaket är tillgängliga för att utföra de uppgifter som beskrivs ovan, inklusive Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 och andra. Medan dessa program följer liknande bearbetningssteg använder de olika algoritmer, till exempel för att plocka partiklar, generera initiala modeller och förfina rekonstruktioner. Dessutom kräver dessa program en varierande nivå av användarkunskap och ingripande för att fungera, eftersom vissa är beroende av finjustering av parametrar som kan fungera som ett hinder för nya användare. Dessa avvikelser resulterar ofta i kartor med inkonsekvent kvalitet och upplösning över plattformar14, vilket får många forskare att använda flera mjukvarupaket för att förfina och validera resultat. I den här artikeln belyser vi användningen av cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en högupplöst 3D-rekonstruktion av AAV, en allmänt använd vektor för genterapi15. De ovannämnda mjukvarupaketen är gratis för akademiska användare; cryoSPARC v3 och Scipion 3 kräver licenser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln presenterar vi ett robust SPA-arbetsflöde för kryo-EM-databehandling över olika mjukvaruplattformar för att uppnå högupplösta 3D-rekonstruktioner (Figur 1). Detta arbetsflöde är tillämpligt på en mängd olika biologiska makromolekyler. De efterföljande stegen i protokollet beskrivs i figur 4, inklusive förbehandling av film, partikelplockning och klassificering samt flera metoder för strukturförfining (tabell <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Carlos Oscar Sorzano för hjälp med Scipion3 installation och Kilian Schnelle och Arne Moeller för hjälp med dataöverföring mellan olika bearbetningsplattformar. En del av denna forskning stöddes av NIH-anslaget U24GM129547 och utfördes vid PNCC vid OHSU och nås via EMSL (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsrad av Office of Biological and Environmental Research. Denna studie stöddes av ett startbidrag från Rutgers University till Arek Kulczyk.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
References
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
