Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor niet-invasieve genetische bemonstering van vlinderpopulaties op basis van de veldverzameling van resterend eipuin. Het kan worden gebruikt om de identiteit van soorten te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan bredere groepen voor betrokkenheid van de gemeenschap bij de wetenschap.
De wereldwijde achteruitgang van insecten blijft versnellen. Effectieve genetische bemonstering is van cruciaal belang om het begrip van veel taxa te bevorderen en bestaande kennislacunes aan te pakken. Dit protocol vertegenwoordigt een gedemonstreerde methode voor het niet-destructief bemonsteren van zeldzame vlinders voor populatiegenetische structuur of DNA-barcoderingsanalyses. Het maakt gebruik van het chorion van uitgekomen vlinderovae om voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit DNA te produceren voor succesvolle gensequencing om de identiteit van de soort te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Het kan met name nuttig zijn wanneer andere weefselbemonsteringstechnieken onpraktisch of niet beschikbaar zijn. Hoewel ontwikkeld voor een lepidoptera, kan het toch gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere insectensoorten. Het is speciaal ontworpen met gebruiksgemak als doel om de brede implementatie te maximaliseren door personen met verschillende ervarings- en vaardigheidsniveaus, zoals gemeenschapswetenschappers, natuurbeschermers en studenten, en voor gebruik in grote geografische gebieden om brede populatiesteekproeven te vergemakkelijken. De gegenereerde gegevens kunnen helpen bij het informeren van taxonomische en lijstbeslissingen, instandhoudings- en beheeracties en het verbeteren van fundamenteel ecologisch onderzoek.
Effectieve populatie genetische bemonstering van zeldzame, afnemende en / of vermelde insectentaxa is vaak van cruciaal belang om instandhoudings- en beheeracties te helpen informeren. Dodelijke of schadelijke weefselbemonsteringsmethoden worden routinematig gebruikt voor veel genetische analyses. Deze methoden zijn echter ongewenst of niet toegestaan omdat ze schade kunnen toebrengen aan kwetsbare bestaande populaties of een negatieve invloed kunnen hebben op gedrag en fitheid. Verschillende niet-dodelijke of niet-invasieve bemonsteringstechnieken waarbij weefsel betrokken is, zoals hele benen, antenne- of vleugelmaaisel, larvale exuviae of hemolymfe van defensieve afscheidingen en andere producten, zoals frass, zijn geschikt voor genetisch onderzoek van insecten 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . De algehele haalbaarheid en toepasbaarheid van deze verschillende weefselbemonsteringstechnieken variëren aanzienlijk op basis van de biologie, ecologie, gedrag, grootte en zeldzaamheid van het focale organisme, de situatie en individuen die het materiaal verzamelen. Hele benen of aanhangselknipsels vereisen bijvoorbeeld tijdelijke vangst en zorgvuldige behandeling van verschillende personen in een geschikte levensfase, meestal door ervaren personeel. Evenzo zijn weefselbronnen, zoals larvale exuviae of frass, waarschijnlijk alleen praktisch als de organismen in gevangenschap zijn of tijdelijk gedurende een voldoende periode worden vastgehouden.
Voor onderzoeksvragen die op populatieniveau worden gesteld, zoals die met betrekking tot mogelijke taxonomische differentiatie of genetische structuur, is vaak bemonstering op een bredere temporele of geografische schaal (d.w.z. regionaal of continentaal) vereist. Als gevolg hiervan kunnen bepaalde niet-invasieve weefselbronnen volledig onpraktisch of op zijn minst inefficiënt zijn om in hoeveelheid te verzamelen. Monsterverzameling op dergelijke schaal kan bovendien logistiek of financieel onpraktisch of onbetaalbaar zijn voor individuele onderzoekers of zelfs kleinere veldteams om te ondernemen. Hoewel de directe betrokkenheid van gemeenschapswetenschappers in toenemende mate door de onderzoeksgemeenschap is overgenomen om veel van deze uitdagingen aan te pakken en big data-gedreven verzameling te versnellen, is de acceptatie beperkt voor studies met niet-destructieve, niet-invasieve of eDNA-bemonstering 10,11,12.
Om een aantal van deze potentiële beperkingen te overwinnen, hebben we aangetoond dat het chorion van uitgekomen vlinderovae voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit DNA kon opleveren voor succesvolle gensequencing om de identiteit van de soort te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Vervolgens hebben we verschillende verzamelprotocollen getest met behulp van deze techniek13. Dit proefwerk diende als basis voor verdere methodologische verfijning. Dit artikel beschrijft in detail het resulterende eenvoudige maar uitgebreide herziene veldverzamelingsprotocol dat is uitgerold voor gemeenschapswetenschappers en ander niet-deskundig personeel. Dit protocol maakt deel uit van een populatiestructuuranalyse van de frosted elfin butterfly (Callophrys irus) om toekomstige instandhoudingsacties en een federale bepaling van mogelijke opname onder de Amerikaanse Endangered Species Act te helpen informeren. Hoewel potentieel arbeidsintensiever dan sommige niet-invasieve methoden, maakt het gebrek aan noodzakelijk contact met organismen en gebruiksgemak het een potentieel levensvatbaar model dat kan worden toegepast op andere populatiegenetische onderzoeksprogramma’s die gericht zijn op een selectie van zowel gewone insecten als die van instandhoudingszorg, die resterende eiresten achterlaten van recent uitgekomen nimfen of larven. De hier gepresenteerde protocoltaal is speciaal ontwikkeld voor vlinders in de familie Lycaenidae en voor gebruik door niet-experts die hier worden gedefinieerd als gemeenschapswetenschappers of andere individuen (bijv. Bureaubiologen, stagiaires) met beperkte entomologische ervaring.
Dit protocol beschrijft een veldmethode voor het niet-destructief bemonsteren van zeldzame vlinders voor populatiegenetische structuur- of DNA-barcoderingsanalyses. De algemene voordelen van dit protocol zijn specifiek ontworpen om de brede implementatie te maximaliseren door personen met verschillende ervarings- en vaardigheidsniveaus, zoals gemeenschapswetenschappers, natuurbeschermers en studenten. Deze omvatten relatief lage totale kosten, gemakkelijk aan te schaffen benodigdheden en apparatuur, een eenvoudige en toegankelijke methode zonder tal van al te complexe stappen en eenvoudige implementatie over een breed geografisch gebied. Het richt zich bovendien op resterend organisch materiaal dat de noodzaak elimineert om tijdelijk te vangen of te manipuleren, en in het proces mogelijk levende organismen schaadt om genetische monsters te verkrijgen. Bovendien verlengt het de potentiële periode die beschikbaar is voor monsterverzameling buiten de traditionele fenologie of levensduur van een bepaalde levensfase, waardoor de flexibiliteit en de algehele verzamelmogelijkheid worden verbeterd om het aantal monsters te maximaliseren.
Hoewel het centrale taxon voor deze inspanning de bevroren elfenvlinder was, een wijdverspreide maar afnemende habitatspecialist, kan dit protocol breder worden toegepast op vele andere insecten, waaronder die van zorg voor natuurbehoud. Evenzo, terwijl het protocol zich richt op het verzamelen van uitgekomen eieren als de bron van genetisch materiaal, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere, mogelijk meer traditionele monsters (bijv. Benen, vleugelfragmenten, antenneklemmen) of zelfs hele organismen. Dit aspect is echter ook een mogelijke beperking van het protocol. Hoewel de overgrote meerderheid van de stappen is ontworpen om relatief eenvoudig en snel te bereiken te zijn, is het uitgebreid zoeken naar stukjes larvale waardplanten naar broedeieren, die individueel meestal < 1,0 mm in diameter zijn, tijd- en arbeidsintensief. Niettemin is zo'n uitgebreide bemonsteringsactiviteit vooral ideaal voor een groter netwerk van deelnemers, zoals gemeenschapswetenschappers.
Net als bij andere veldprojecten is een zorgvuldige voorbereiding essentieel. Dit omvat het uitvoeren van een volledige inventaris van de benodigdheden die nodig zijn om ervoor te zorgen dat er geen items ontbreken, dat alle vereiste voorbereidingswerkzaamheden zijn voltooid en dat ze goed georganiseerd, veilig verpakt en klaar zijn voor inzet in het veld. Bovendien moet al het veldpersoneel, met name degenen die de weefselverzameling uitvoeren, het verzamelprotocol in detail bekijken voorafgaand aan een verzamelevenement en eventuele vragen richten aan personen die toezicht houden op het project. Eenmaal in het veld vereist het monsterverzamelingsgedeelte van het protocol nauwgezette aandacht voor detail. Dit omvat het lokaliseren en zorgvuldig inspecteren van eicellen om ervoor te zorgen dat ze zijn uitgebroed en dus geschikt zijn voor verzameling, het grondig reinigen van een tang, het vervangen van handschoenen om weefseloverdracht tussen bemonsteringsgebeurtenissen te helpen verminderen en ervoor zorgen dat weefselmonsters volledig worden ondergedompeld in lysisbuffer in elke microcentrifugebuis van 1,5 ml. Ten slotte is het vastleggen van nauwkeurige en gedetailleerde gegevens van essentieel belang, waaronder het koppelen van het unieke ID-label dat aan de microcentrifugebuis is toegewezen, samen met het specifieke monster dat is genomen en alle andere relevante verzamelinformatie. Hoewel deze stap routine is in wetenschappelijk onderzoek, moet deze vaak grondig worden verduidelijkt en versterkt voor een gemeenschapswetenschappelijk publiek.
Hier demonstreren we het potentiële gebruik van gemeenschapswetenschappers voor niet-dodelijke monsterverzameling van kleine, zeldzame en bedreigde soorten. Er zijn echter enkele mogelijke beperkingen om in gedachten te houden bij het analyseren van resulterende genetische gegevens. Bijvoorbeeld, terwijl het poolen van monsters van een enkele patch de kans vergroot om voldoende DNA te herstellen voor detectie, introduceert het mogelijk ook heterozygositeit. Bovendien, omdat het protocol betrekking heeft op het verzamelen van het chorion van uitgekomen eicellen, kunnen alleen vrouwelijke vlinders, die ouderlijk DNA vertegenwoordigen, binnen een populatie worden bemonsterd. Aangezien er echter geen eerdere genetische gegevens op populatieniveau beschikbaar waren voor C. irus, kunnen de verkregen inzichten alleen het behoud en beheer van soorten ten goede komen. Bijvoorbeeld, terwijl een grondig, gedetailleerd onderzoeksontwerp en zorgvuldige markerselectie nodig zouden zijn om de populatiestructuur adequaat te beoordelen, zou het hier geschetste bemonsteringsprotocol en het gebruik van cytochroom c-oxidase subunit 1 (CO1) DNA-barcoding kunnen worden gebruikt om het optreden van zeldzame of bedreigde taxa te detecteren. Aanvullende bespreking van het nut en de toepassing van DNA-sequencing van niet-dodelijke bemonstering die hier wordt beschreven, wordt gedetailleerd beschreven door Storer et. al.14.
Naast het primaire doel van het verzamelen van monsters voor genetische analyse, benadrukt het protocol ook dat deelnemers gedetailleerde digitale foto’s maken van alle veldlocaties, verzamellocaties, aanwezige larvale waardplanten en andere elementen van de omliggende habitat die relevant kunnen zijn. Dergelijke documentatie helpt bij het bieden van een algemene habitatbeoordeling die nuttig is om bestaande locatieomstandigheden te illustreren, zoals plantenfenologie, dichtheid van gastheerbronnen en beheergeschiedenis (bijv. Recent voorgeschreven brand). Dergelijke informatie is met name nuttig voor projecten waarbij veldmonsters worden genomen over een bredere periode om meer gedetailleerde milieuvergelijkingen mogelijk te maken.
Ten slotte, naarmate de wereldwijde achteruitgang van insecten blijft versnellen, zijn uitgebreide inspanningen voor de beoordeling en monitoring van soorten van cruciaal belang15,16. Het gebruik van meer wijdverspreide participatieve betrokkenheid van gemeenschapswetenschappers, studenten (bijv. U.S. Fish and Wildlife Service-stagiairs en fellows) en natuurbeschermers biedt steeds haalbare opties voor uitgebreide gegevensverzameling van vele soorten, waaronder DNA-monsters. Dienovereenkomstig hebben de gegevens die uit dit protocol worden gegenereerd veel mogelijke toepassingen. Deze omvatten het helpen informeren van instandhoudingsacties (bijv. Planning, herstel en beheer), het inventariseren van beslissingen of beoordelingen van de status van soorten, en ecologisch, populatie- en taxonomisch onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge en Jessup Weichelt bedanken voor hulp bij verschillende aspecten van het project, waaronder logistiek, coördinatie, vergunningen en / of monsterverzameling. Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van de U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) beheerd door het Wildlife Management Institute (subsidie SA 2021-01).
14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
packing material Amount per deployable unit: as needed |