Här presenterar vi ett enkelt protokoll för icke-invasiv genetisk provtagning av fjärilspopulationer baserat på fältinsamling av kvarvarande äggskräp. Den kan användas för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Detta protokoll kan enkelt anpassas till bredare grupper för samhällsvetenskapligt engagemang.
De globala insektsminskningarna fortsätter att accelerera. Effektiv genetisk provtagning behövs kritiskt för att öka förståelsen för många taxa och ta itu med befintliga kunskapsluckor. Detta protokoll representerar en demonstrerad metod för icke-förstörande provtagning av sällsynta fjärilar för populationsgenetisk struktur eller DNA-streckkodningsanalyser. Den använder korionen av kläckta fjärilsägg för att ge tillräckligt hög kvantitet och kvalitets-DNA för framgångsrik gensekvensering för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Det kan vara särskilt användbart när andra vävnadsprovtagningstekniker är opraktiska eller otillgängliga. Även om den är utvecklad för en lepidopteran, kan den ändå lätt anpassas för användning med andra insektsarter. Det var speciellt utformat med användarvänlighet som ett mål att hjälpa till att maximera bred implementering av individer med varierande erfarenhet och färdighetsnivåer, såsom samhällsforskare, bevarandeutövare och studenter, och för användning över stora geografiska områden för att underlätta bred befolkningsprovtagning. De data som genereras kan bidra till att informera taxonomiska och listningsbeslut, bevarande- och förvaltningsåtgärder och förbättra grundläggande ekologisk forskning.
Effektiv populationsgenetisk provtagning av sällsynta, minskande och/eller listade insektstaxa är ofta avgörande för att bidra till bevarande- och förvaltningsåtgärder. Dödliga eller skadliga vävnadsprovtagningsmetoder används rutinmässigt för många genetiska analyser. Dessa metoder är dock oönskade eller inte tillåtna eftersom de kan orsaka skada på sårbara befintliga populationer eller negativt påverka beteende och kondition. Olika nonlethal eller icke-invasiva provtagningstekniker som involverar vävnad som hela ben, antenn- eller vingklipp, larvexuviae eller hemolymf från defensiva sekret och andra produkter, såsom frass, har varit lämpliga för insektsgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den övergripande genomförbarheten och tillämpligheten av dessa olika vävnadsprovtagningstekniker varierar avsevärt beroende på biologi, ekologi, beteende, storlek och sällsynthet hos fokalorganismen, situationen och individerna som samlar in materialet. Till exempel kräver hela ben eller bihangklipp tillfällig fångst och noggrann hantering av flera individer i ett lämpligt livsstadium, vanligtvis av erfaren personal. På samma sätt är vävnadskällor, såsom larvexuviae eller frass, sannolikt endast praktiska om organismerna är i fångenskap eller tillfälligt hålls i en tillräcklig period.
För forskningsfrågor som ställs på populationsnivå, t.ex. sådana som rör potentiell taxonomisk differentiering eller genetisk struktur, krävs ofta provtagning på en bredare tidsmässig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental). Som ett resultat kan vissa icke-invasiva vävnadskällor vara helt opraktiska eller åtminstone ineffektiva att samla in i kvantitet. Provtagning i sådana skalor kan dessutom vara logistiskt eller ekonomiskt opraktiskt eller oöverkomligt för enskilda forskare eller till och med mindre fältteam att genomföra. Medan det direkta engagemanget från samhällsforskare i allt högre grad har antagits av forskarsamhället för att hjälpa till att ta itu med många av dessa utmaningar och påskynda stordatadriven insamling, har antagandet varit begränsat för studier som involverar icke-förstörande, icke-invasiv eller eDNA-provtagning10,11,12.
För att hjälpa till att övervinna några av dessa potentiella begränsningar visade vi att korionen från kläckta fjärilsägg kan ge tillräckligt hög kvantitet och kvalitets-DNA för framgångsrik gensekvensering för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Vi testade därefter olika insamlingsprotokoll med denna teknik13. Detta pilotarbete fungerade som grund för ytterligare metodisk förfining. Detta dokument beskriver i detalj det resulterande enkla men ändå omfattande reviderade fältinsamlingsprotokollet som rullades ut för samhällsforskare och annan icke-expertpersonal. Detta protokoll är en del av en områdesomfattande populationsstrukturanalys av den frostat elfenbensfjärilen (Callophrys irus) för att hjälpa till att informera framtida bevarandeåtgärder och en federal bestämning av eventuellt listning enligt U.S. Endangered Species Act. Även om det potentiellt är mer arbetskrävande än vissa icke-invasiva metoder, gör bristen på nödvändig organismkontakt och användarvänlighet det till en potentiellt livskraftig modell som kan tillämpas på andra populationsgenetiska forskningsprogram som riktar sig till ett urval av både vanliga insekter och de av bevarandeproblem, som lämnar kvarvarande äggskräp efter sig från nyligen kläckta nymfer eller larver. Protokollspråket som presenteras här utvecklades specifikt för fjärilar i familjen Lycaenidae och för användning av icke-experter som här definieras som samhällsforskare eller andra individer (t.ex. byråbiologer, praktikanter) med begränsad entomologisk erfarenhet.
Detta protokoll beskriver en fältmetod för icke-förstörande provtagning av sällsynta fjärilar för populationsgenetisk struktur eller DNA-streckkodningsanalyser. De övergripande fördelarna med detta protokoll är specifikt utformade för att maximera bred implementering av individer med varierande erfarenhet och färdighetsnivåer som samhällsforskare, bevarandeutövare och studenter. Dessa inkluderar relativt låg totalkostnad, lätt att skaffa förnödenheter och utrustning, en enkel och tillgänglig metod utan många alltför komplexa steg och enkel distribution över ett brett geografiskt område. Det riktar sig dessutom mot kvarvarande organiskt material som eliminerar behovet av att tillfälligt fånga eller manipulera, och i processen potentiellt skada levande organismer för att förvärva genetiska prover. Dessutom förlänger det den potentiella perioden som är tillgänglig för provinsamling utöver den traditionella fenologin eller livslängden för ett visst livsstadium, vilket ökar flexibiliteten och den övergripande insamlingsmöjligheten för att maximera provantalet.
Medan det centrala taxonet för denna insats var den frostat alfinnefjärilen, en utbredd men minskande livsmiljöspecialist, kan detta protokoll tillämpas bredare på många andra insekter, inklusive de som är av bevarandeintresse. På samma sätt, medan protokollet är inriktat på insamling av kläckta ägg som källa till genetiskt material, kan det enkelt anpassas till andra, potentiellt mer traditionella prover (t.ex. ben, vingfragment, antennklämmor) eller till och med hela organismer. Denna aspekt är emellertid också en potentiell begränsning av protokollet. Även om de allra flesta stegen är utformade för att vara relativt enkla och snabba att utföra, är det tids- och arbetskrävande att fullständigt söka fläckar av larvvärdväxter efter kläckägg, som individuellt vanligtvis är < 1,0 mm i diameter. Icke desto mindre är en sådan omfattande provtagningsaktivitet särskilt idealisk för ett större nätverk av deltagare som samhällsforskare.
Som med andra fältbaserade projekt är noggranna förberedelser viktiga. Detta inkluderar att genomföra en fullständig inventering av de förnödenheter som behövs för att säkerställa att inga artiklar saknas, att allt nödvändigt förberedelsearbete har slutförts och att de är välorganiserade, säkert förpackade och redo för fältdistribution. Dessutom bör all fältpersonal, särskilt de som utför vävnadsinsamlingen, granska insamlingsprotokollet i detalj före varje insamlingshändelse och ställa frågor till personer som övervakar projektet. Väl i fältet kräver provsamlingsdelen av protokollet noggrann uppmärksamhet på detaljer. Detta inkluderar att lokalisera och noggrant inspektera alla ägg för att säkerställa att de är kläckta och därmed lämpliga för insamling, noggrant rengöra tång, byta ut handskar för att minska vävnadsöverföringen mellan provtagningshändelser och se till att vävnadsprover är helt nedsänkta i lysbuffert inom varje 1,5 ml mikrocentrifugrör. Slutligen är det viktigt att registrera korrekta och detaljerade data, vilket inkluderar att länka den unika ID-etiketten som tilldelats från mikrocentrifugröret tillsammans med det specifika provet som tagits och all annan relevant insamlingsinformation. Även om detta steg är rutin i vetenskaplig forskning, måste det ofta klargöras och förstärkas grundligt för en samhällsvetenskaplig publik.
Här demonstrerar vi potentialen för samhällsforskare för icke-dödlig provinsamling från små, sällsynta och hotade arter. Det finns dock vissa potentiella begränsningar att tänka på när man analyserar eventuella resulterande genetiska data. Till exempel, medan sammanslagning av prover från ett enda plåster ökar chansen att återvinna tillräckligt med DNA för detektion, introducerar det också potentiellt heterozygositet. Dessutom, eftersom protokollet innebär att korionen samlas in från kläckta ovae, kan endast kvinnliga fjärilar, som representerar föräldra-DNA, provtas inom en population. Eftersom det inte fanns några tidigare genetiska data på populationsnivå för C. irus, kan de insikter som erhållits endast gynna artbevarande och förvaltning. Till exempel, medan en grundlig, detaljerad studiedesign och noggrant markörval skulle krävas för att på ett adekvat sätt bedöma befolkningsstrukturen, kan provtagningsprotokollet som beskrivs här och användningen av cytokrom coxidasunderenhet 1 (CO1) DNA-streckkodning användas för att upptäcka förekomsten av sällsynta eller imperiled taxa. Ytterligare diskussion om nyttan och tillämpningen av DNA-sekvensering från nonlethal provtagning som beskrivs här beskrivs av Storer et. al.14.
Utöver det primära målet att samla in prover för genetisk analys betonar protokollet också att deltagarna tar detaljerade digitala fotografier av alla fältplatser, samlingsplatser, larvvärdväxter som finns och alla andra delar av den omgivande livsmiljön som kan vara relevanta. Sådan dokumentation hjälper till att tillhandahålla en allmän livsmiljöbedömning som är användbar för att illustrera befintliga områdesförhållanden som växtfenologi, värdresurstäthet och förvaltningshistorik (t.ex. nyligen föreskriven brand). Sådan information är särskilt användbar för projekt där fältprover tas under en längre tidsperiod för att möjliggöra mer detaljerade miljöjämförelser.
Slutligen, eftersom den globala insektsminskningen fortsätter att accelerera, behövs det kritiskt utökade artbedömningar och övervakningsinsatser15,16. Användningen av mer utbrett deltagande engagemang från samhällsforskare, studenter (t.ex. praktikanter och stipendiater från US Fish and Wildlife Service) och bevarandeutövare erbjuder alltmer livskraftiga alternativ för omfattande datainsamling av många typer, inklusive DNA-prover. Följaktligen har data som genereras från detta protokoll många möjliga användningsområden. Dessa inkluderar att hjälpa till att informera bevarandeåtgärder (t.ex. planering, återhämtning och förvaltning), listningsbeslut eller bedömningar av artstatus och ekologisk, populations- och taxonomisk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge och Jessup Weichelt för hjälp med olika aspekter av projektet, inklusive logistik, samordning, tillstånd och / eller provinsamling. Denna forskning finansierades genom ett bidrag från U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) som administreras av Wildlife Management Institute (bidrag SA 2021-01).
14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
packing material Amount per deployable unit: as needed |