Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

Summary

A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.

Abstract

Os motores de cinesina bipolar mitotítica-5 desempenham funções essenciais na dinâmica do fuso. Estes motores exibem uma estrutura homo-tetramérica com dois pares de domínios motores catalíticos, localizados em extremidades opostas do complexo ativo. Esta arquitetura única permite que os motores kinesin-5 cruzem e deslizem para além de microtúbulos de eixo antiparaol (MTs), fornecendo assim a força direcionada externamente que separa os polos do eixo. Anteriormente, acreditava-se que os motores kinesin-5 eram exclusivamente mais-end dirigidos. No entanto, estudos recentes revelaram que vários motores fúngicos de cinesina-5 são menos-finais direcionados ao nível de molécula única e podem mudar a direcionalidade em várias condições experimentais. O Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 é um exemplo de tal proteína motora bidirecional: em alta resistência iônica, moléculas únicas de Cin8 se movem na direção menos final dos MTs. Também foi demonstrado que o Cin8 forma clusters motile, predominantemente na extremidade inferior dos MTs, e tal agrupamento permite que Cin8 mude de direcionalidade e se submeta a motilidade direcionada lenta e plus-end. Este artigo fornece um protocolo detalhado para todas as etapas de trabalho com kinesin-5 Cin8 marcado por GFP, desde a superexpressão de proteínas em células S. cerevisiae e sua purificação até o ensaio de motilidade de molécula única in vitro . Um método recém-desenvolvido descrito aqui ajuda a diferenciar entre moléculas únicas e aglomerados de Cin8, com base em sua intensidade de fluorescência. Este método permite a análise separada da motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8, proporcionando assim a caracterização da dependência da motilidade Cin8 em seu tamanho de cluster.

Introduction

Um grande número de eventos de motilidade dentro das células eucarióticas são mediados pela função das proteínas motoras moleculares. Esses motores se movem ao longo dos filamentos citoesqueléticos, filamentos de actin e microtúbulos (MTs), e convertem a energia química da hidrólise ATP em forças cinéticas e mecânicas necessárias para conduzir a motilidade biológica dentro das células. O S. cerevisiae Cin8, baseado em MT, é uma proteína motora bipolar, homotetrameric quinase-5 que cruza e desliza MTs de eixo¹. O Cin8 executa funções essenciais durante a mitose, na montagem do eixo ^2,3,4 e no alongamento do eixo durante a anafase ^5,6,7. Anteriormente, havia sido demonstrado que o Cin8 é um motor bidirecional, que muda a direcionalidade em diferentes condições experimentais. Por exemplo, sob altas condições de resistência iônica, motores Cin8 únicos movem-se em direção à extremidade inferior dos MTs, enquanto em clusters, em ensaios de deslizamento MT multimotores, e entre MTs antiparalhais, os motores Cin8 movem-se principalmente em direção às extremidades mais altas dos MTs 8,9,10,11,12 . Esses achados foram altamente inesperados por várias razões. Primeiro, o Cin8 carrega seu domínio motor catalítico no amino-terminus e tais motores foram previamente acreditados como exclusivamente mais-end dirigidos, enquanto Cin8 foi mostrado ser menos-fim direcionado ao nível de molécula única. Em segundo lugar, acreditava-se que os motores de cinesina eram unidirecionais, seja de ponta ou de ponta, enquanto o Cin8 mostrou-se bi-direcional, dependendo das condições experimentais. Finalmente, por causa da orientação em MT no fuso mitótico, o papel clássico dos motores cinesina-5 na separação de postes de fuso durante a montagem do fuso e da anfífase B só poderia ser explicado por sua motilidade direcionada plus-end nos MTs que eles cruzam ^1,13. Após os primeiros relatos sobre a bidirecionalidade do Cin8, alguns outros motores de cinesina foram demonstrados como bi-direcionais 14,15,16, indicando que a motilidade bidirecional dos motores de cinesina pode ser mais comum do que se acreditava anteriormente.

Foi relatado anteriormente que nas células, o Cin8 também se move de forma bidirecional⁸, apoiando a noção de que a motilidade bidirecional de alguns motores cinesin-5 é importante para suas funções intracelulares. Além disso, uma vez que os três motores cinesin-5 que foram relatados como bidirecionais são de células fúngicas, um possível papel para a bidalidade bi-direcionalidade dos motores cinesin-5 foi recentemente proposto nessas células¹⁰. De acordo com este modelo, em mitose fechada de células fúngicas, onde o envelope nuclear não quebra durante a mitose, os motores de quinase-5 fornecem a força inicial que separa os polos do eixo antes da montagem do eixo. Para realizar esta tarefa, antes da separação do polo de fuso, os motores kinesin-5 localizam-se perto dos polos de fuso, por sua motilidade direcionada sem fim em MTs nucleares únicos. Uma vez nesta posição, os motores kinesin-5 agrupam, alternam direcionalidade, capturam e cruzam MTs de postes de fuso vizinhos. Posteriormente, os motores kinesin-5 fornecem a separação inicial dos polos por motilidade dirigida plus-end nos MTs que eles cruzam. Por este modelo, tanto a motilidade dirigida por fim em MTs único quanto a motilidade direcionada plus-end em MTs transversais durante o deslizamento antiparal são necessárias para que os motores fúngicos kinesin-5 realizem seus papéis na montagem^{do eixo 1,13}.

O objetivo geral do método descrito é obter kinesina-5 Cin8 marcada por FFP de alta pureza e realizar ensaios de motilidade de molécula única (Figura 1) enquanto analisa separadamente a motilidade de moléculas únicas e aglomerados de Cin8. A separação entre moléculas únicas e aglomerados é importante, uma vez que um dos fatores que foram demonstrados para afetar a direcionalidade do Cin8 é o seu acúmulo em clusters nos MTs^10,12. Ensaios alternativos de motilidade, como o deslizamento de superfície mt e ensaios deslizantes de MT não fornecem informações sobre a atividade de proteínas motoras únicas ^17,18. Os robustos métodos de ensaio e análise de motilidade de molécula única descritos aqui foram aplicados com sucesso para caracterizar diferentes aspectos dos motores kinesin-5, Cin8 e Kip1 10,11,12,14,19,20.

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a superexpressão e purificação do Cin8, polimerização de MTs e o ensaio de motilidade de molécula única. Além disso, também são descritas as análises para diferenciar moléculas e aglomerados únicos de Cin8 e determinar velocidades motoras e cluster únicas por deslocamento médio (MD) e análise média de deslocamento quadrado (MSD). Este protocolo tem como objetivo ajudar os pesquisadores a visualizar todas as etapas dos procedimentos e auxiliar na solução de problemas desse tipo de ensaio.

Figura 1: Representação esquemática do ensaio de motilidade de molécula única. Os MTs fluorescentes biotinilados são anexados à superfície de vidro, revestidos com o Avidin que interage com o biotinilado-BSA conectado à superfície. O arqueiro verde representa a direção de movimento de moléculas cin8 únicas sob altas condições de resistência iônica. +/- representar a polaridade do MT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparação de tampões e reagentes Buffers -Leu aa dropout mix: Misture 2 g cada de Adenina, Uracil, Triptofano, Histidine, Lysine e Methionine e armazene à temperatura ambiente. Levedura meio seletivo com raffinose (1 L): Misture 6,7 g de base de nitrogênio de levedura (com sulfato de amônio), 2 g de mistura de gota de -Leu aa e 20 g de raffinose em água dupla destilada, mexendo (sem aquecimento) até totalmente dissolvida. Usando um filtro de 0,22 μm, filtre a sol…

Representative Results

O experimento tem como objetivo investigar as características de motilidade da proteína motora bidirecional Cin8 de diferentes tamanhos de cluster em MTs únicos. A motilidade representativa do Cin8-GFP também é evidente a partir dos kymographs na Figura 5A, onde a posição espacial do motor ao longo do tempo é mostrada. Para a análise das propriedades motile do Cin8-GFP, primeiro, o tamanho do cluster é atribuído (etapa 4.3) a cada partícula cin8-GFP an…

Discussion

Neste trabalho, é apresentado um protocolo para ensaio de motilidade de molécula única com a cinesina bidirecional-5 Cin8 e a análise de motilidade. O Cin8¹⁸ de comprimento completo, incluindo o sinal de localização nuclear nativa (NLS) no terminal C foi purificado do hospedeiro nativo S. cerevisiae. Como o Cin8 é uma proteína motora nuclear, moer as células S. cerevisiae sob nitrogênio líquido é considerado o método mais eficiente para a lise celular. Após a lise, …

Materials

Adenine	FORMEDIUM	DOC0230
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	Sigma	A8549
Casein	Sigma	C7078
Catalase (C40)	Sigma	C40
Creatine-Kinase	Sigma	C3755
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
EDTA	Sigma	E5134
EGTA	Sigma	E4378
Fluorescence filter set for GFP	Chroma	49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for Rhodamine	Chroma	49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscope	Zeiss	Axiovert 200M
Galactose	Tivan Biotech	GAL02
Glucose	Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Sigma	G7141
Glycerol	Sigma	G5516
GlycylGlycine	Merck	G0674
GMPCPP	Jana Bioscience	Nu-405L
GTB	Cytoskeleton	BST01-010
GTP	Sigma	G8877
Histidine	Duchefa Biochemie	H0710.0100
ImageJ-FIJI software	https://imagej.net/plugins/trackmate/	version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
Imidazole	Sigma	I0125
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Abcam	ab119211
Lens	Zeiss	100x/1.4 oil DIC objective
Lysine	FORMEDIUM	DOC0161
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Methionine	Duchefa Biochemie	M0715.0100
Neo	Andor Technologies	sCMOS camera
NeutraAvidin	Life	A2666
Ni-NTA Agarose	Invitrogen	R901-15
Phospho-Creatine	Sigma	P1937
Pipes	Sigma	P1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)	Sigma	P2443
Potassium Chloride	Sigma	P9541
Raffinose	Tivan Biotech	RAF01
Size Exclusion chromatography instument	GE Healthcare	AKTA Pure
Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	NanoDrop
Superose-6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Tris	Roshe	10708976001
Triton X-100	Sigma	T8787
Tryptophan	Duchefa Biochemie	T0720.0100
Tubulin protein	Cytoskeleton	T240
Tubulin, biotinylated	Cytoskeleton	T333P
Tubulin, TRITC Rhodamine	Cytoskeleton	TL530M
Uracil	Sigma	U0750-100G
Yeast nitrogen base	FORMEDIUM	CYN0401S
α-GFP antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC8036
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148