Utveckling av organoider från mus hypofysen som in vitro-modell för att utforska hypofysstamcellsbiologi
Summary
Hypofysen är nyckelregulatorn för kroppens endokrina system. Denna artikel beskriver utvecklingen av organoider från musens hypofys som en ny 3D in vitro-modell för att studera körtelns stamcellspopulation av vilken biologin och funktionen förblir dåligt förstådd.
Abstract
Hypofysen är den mästerliga endokrina körteln som reglerar viktiga fysiologiska processer, inklusive kroppstillväxt, ämnesomsättning, sexuell mognad, reproduktion och stressrespons. För mer än ett decennium sedan identifierades stamceller i hypofysen. Trots tillämpningen av transgena in vivo-metoder är deras fenotyp, biologi och roll fortfarande oklara. För att ta itu med denna gåta utvecklas en ny och innovativ organoid in vitro-modell för att djupt riva upp hypofysstamcellsbiologi. Organoider representerar 3D-cellstrukturer som, under definierade odlingsförhållanden, själv utvecklas från en vävnads (epitel) stamceller och rekapitulerar flera kännetecken för dessa stamceller och deras vävnad. Det visas här att mus hypofys-härledda organoider utvecklas från körtelns stamceller och troget rekapitulerar deras in vivo fenotypiska och funktionella egenskaper. Bland annat reproducerar de aktiveringstillståndet hos stamcellerna som in vivo som uppstår som svar på transgeniskt orsakad lokal skada. Organoiderna är långsiktigt expanderbara samtidigt som de robust behåller sin stamfenotyp. Den nya forskningsmodellen är mycket värdefull för att dechiffrera stamcellernas fenotyp och beteende under viktiga förhållanden för hypofysombyggnad, allt från neonatal mognad till åldringsassocierad blekning och från friska till sjuka körtlar. Här presenteras ett detaljerat protokoll för att etablera mus hypofys-härledda organoider, som ger ett kraftfullt verktyg för att dyka in i den ännu gåtfulla världen av hypofysstamceller.
Introduction
Hypofysen är en liten endokrin körtel som ligger vid hjärnans botten, där den är kopplad till hypotalamus. Körteln integrerar perifera och centrala (hypotalamiska) ingångar för att generera en avstämd och samordnad hormonfrisättning och därigenom reglera nedströms mål endokrina organ (såsom binjurar och gonader) för att producera lämpliga hormoner vid rätt tidpunkt. Hypofysen är nyckelregulatorn för det endokrina systemet och kallas därför med rätta masterkörteln1.
Musens hypofys består av tre lober (figur 1), dvs den främre loben (AL), mellanloben (IL) och den bakre loben (PL). Den stora endokrina AL innehåller fem hormonella celltyper, inklusive somatotroper som producerar tillväxthormon (GH); laktotroper som genererar prolaktin (PRL); kortikotroper som utsöndrar adrenokortikotropt hormon (ACTH); tyrotroper som är ansvariga för sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) produktion; och gonadotroper som gör luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). PL består av axonala projektioner från hypotalamus där hormonerna oxytocin och vasopressin (antidiuretiskt hormon) lagras. IL ligger mellan AL och PL och rymmer melanotroper som producerar melanocytstimulerande hormon (MSH). I den mänskliga hypofysen regresserar IL under utvecklingen, och melanotroper sprids inom AL1. Förutom de endokrina cellerna innehåller hypofysen också en pool av stamceller, väsentligen markerade med transkriptionsfaktorn SOX2 2,3,4,5,6. Dessa SOX2+ -celler är belägna i marginalzonen (MZ), epitelfodret i klyftan (en embryonal restlumen mellan AL och IL), eller sprids som kluster genom AL: s parenkym och föreslår därmed två stamcellsnischer i körteln (Figur 1) 2,3,4,5,6.
Med tanke på hypofysens oumbärliga natur är funktionsfel i körteln förknippad med allvarlig sjuklighet. Hyperpituitarism (kännetecknad av översekretion av ett eller flera hormoner) och hypopituitarism (defekt eller saknad produktion av ett eller flera hormoner) kan orsakas av hypofysneuroendokrina tumörer (PitNETs; t.ex. ACTH-producerande tumörer som leder till Cushings sjukdom) eller av genetiska defekter (t.ex. GH-brist som resulterar i dvärgväxt)7. Dessutom är hypofyskirurgi (t.ex. för att avlägsna tumörer), infektioner (t.ex. hypotalamus-hypofys tuberkulos eller infektioner efter bakteriell meningit eller encefalit), Sheehans syndrom (nekros på grund av otillräckligt blodflöde på grund av kraftig blodförlust vid födseln), hypofysapoplexi och traumatisk hjärnskada andra viktiga orsaker till hypofyshypofunktion8 . Det har visat sig att mushypofysen har den regenerativa kapaciteten och kan reparera lokala skador som införs genom transgen ablation av endokrina celler 9,10. SOX2+-stamcellerna reagerar akut på den orsakade skadan som visar en aktiverad fenotyp, markerad av ökad proliferation (vilket resulterar i stamcellsexpansion) och ökat uttryck av stamhetsrelaterade faktorer och vägar (t.ex. WNT / NOTCH). Dessutom börjar stamcellerna uttrycka det ablaterade hormonet, vilket slutligen resulterar i en väsentlig återställning av den utarmade cellpopulationen under följande (5 till 6) månader 9,10. Under körtelns neonatala mognadsfas (de första 3 veckorna efter födseln) trivs hypofysstamcellerna i ett aktiverat tillstånd 6,11,12,13, medan organismens åldrande är förknippat med minskad in situ-stamcellsfunktionalitet på grund av en ökande inflammatorisk (mikro-) miljö vid åldrande (eller “inflammatorisk”)10,14 . Dessutom är tumorigenes i körteln också associerad med stamcellsaktivering 7,15. Även om stamcellsaktivering har upptäckts i flera situationer med hypofysombyggnad (granskad i 7,16), är underliggande mekanismer fortfarande oklara. Eftersom in vivo-metoder (såsom härstamningsspårning hos transgena möss) inte har gett en tydlig eller heltäckande bild av hypofysstamceller, är utvecklingen av tillförlitliga in vitro-modeller för att utforska stamcellsbiologi i normal och sjuk hypofys avgörande. Standard in vitro-odling av primära hypofysstamceller är fortfarande otillräcklig på grund av mycket begränsad tillväxtkapacitet och icke-fysiologiska (2D) tillstånd med snabb förlust av fenotyp (för en mer detaljerad översikt, se16). 3D-sfärkulturer (hypofyssfärer) har etablerats från hypofysstamceller som identifierats av sidopopulationen och SOX2+ fenotyp 2,3,4. Hypouisfärerna växer klonalt från stamcellerna, uttrycker stamhetsmarkörer och visar differentieringskapacitet i de endokrina celltyperna. De expanderar dock inte nämn nämnbart samtidigt som de endast visar begränsad passage (2-3 passager)3,4. Sfärliknande strukturer erhölls också från icke-dissocierade hypofysstamcellskluster när de odlades i 50% utspädd Matrigel i 1 vecka, men expanderbarhet visades inte17. Pituisphere-metoden används mest som ett avläsningsverktyg för stamcellsnummer, men ytterligare tillämpningar begränsas av sämre expansionskapacitet16.
För att ta itu med och övervinna dessa brister har en ny 3D-modell nyligen etablerats, dvs organoider, med utgångspunkt från den stora endokrina AL hos möss som innehåller MZ och parenkymala stamceller. Det har visat sig att organoiderna verkligen härrör från hypofysens stamceller och troget rekapitulerar deras fenotyp18. Dessutom är organoiderna långsiktigt expanderbara, samtidigt som de robust bibehåller sin stamhetsnatur. Därför ger de en tillförlitlig metod för att expandera primära hypofysstamceller för djupgående utforskning. En sådan utforskning kan inte uppnås med det begränsade antalet stamceller som kan isoleras från en hypofys, som inte heller kan expanderas under 2D-förhållanden16. Det har visat sig att organoiderna är värdefulla och tillförlitliga verktyg för att avslöja nya hypofysstamcellsegenskaper (översättbara till in vivo)14,18. Viktigt är att organoidmodellen troget speglar hypofysstamcellsaktiveringsstatusen som inträffar under lokal vävnadsskada och neonatal mognad, vilket visar förbättrad bildningseffektivitet och replikerar uppreglerade molekylära vägar14,18. Därför är den hypofys-härledda organoidmodellen en innovativ och kraftfull forskningsmodell för hypofysstamcellsbiologi samt ett stamcellsaktiveringsavläsningsverktyg.
Detta protokoll beskriver i detalj upprättandet av mus hypofys-härledda organoider. För detta syfte isoleras AL och dissocieras i enskilda celler, vilka är inbäddade i extracellulär matris-efterliknande Matrigel (nedan kallad ECM). Cell-ECM-sammansättningen odlas sedan i ett definierat medium, som i huvudsak innehåller stamcellstillväxtfaktorer och hypofysembryonala regulatorer (vidare kallat hypofysorganoidmedium (PitOM)18; Tabell 1). När organoiderna är fullt utvecklade (efter 10-14 dagar) kan de expanderas ytterligare genom sekventiell genomströmspassage och utsättas för omfattande nedströms prospektering (t.ex. immunofluorescens, RT-qPCR och bulk- eller encellstranskriptomik; Figur 1). På längre sikt förväntas hypofysstamcellsorganoiderna bana väg för vävnadsreparationsmetoder och regenerativ medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
De AL-härledda organoiderna, som beskrivs här, representerar en kraftfull forskningsmodell för att studera hypofysstamceller in vitro. För närvarande är detta organoida tillvägagångssätt det enda tillgängliga verktyget för att på ett tillförlitligt och robust sätt odla och expandera primära hypofysstamceller. En hypofysorganoidmodell som härrör från embryonala stamceller (ESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) har rapporterats tidigare, som nära rekapitulerar hypofysembryonal or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven Research Fund och Fund for Scientific Research (FWO) – Flandern. E.L. (11A3320N) och C.N. (1S14218N) stöds av ett Ph.D. Fellowship från FWO / FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
