Summary
이 프로토콜은 변형 된 동맥 해부학 전략에 초점을 맞춘 마우스 신장 이식의 새로운 수술 기술을 제시합니다. 간단하고 안전한 요관-방광 해부학 방법을 포함하는 혈관 봉합 기술도 제시된다. 이러한 변형은 수술 시간을 단축시키고 마우스 신장 이식 절차의 성공률을 향상시킵니다.
Abstract
생쥐의 신장 이식은 복잡하고 도전적인 수술 절차입니다. 이 작업의 핵심 단계를 보여주는 간행물은 거의 없습니다. 따라서이 기사에서는 기술을 소개하고이 수술과 관련된 수술주의 사항을 지적합니다. 또한, 종래의 절차와 비교하여 중요한 변형이 입증된다. 첫째, 복부 대동맥의 패치를 절단하고 요관 동맥을 포함한 신장 동맥의 근위 분기가 기증자 신장 en bloc 과 함께 횡단되도록 준비됩니다. 이것은 요관 괴사의 위험을 줄이고 요로 폐색의 발달을 피합니다. 둘째, 혈관 해부학의 새로운 방법이 신장 이식 재관류가 이미 시작된 후 운영자가 해부학의 크기를 유연하게 증가 또는 감소시킬 수 있음을 입증합니다. 이것은 혈관 협착과 복강 내 출혈의 발달을 피합니다. 셋째, 외상을 일으키지 않는 섬세한 공여체 요관과 수용자 방광의 해부학을 가능하게하는 기술이 표시됩니다. 이 프로토콜을 채택하면 수술 시간을 단축하고 수용자의 방광 손상을 줄일 수 있으므로 수용자 마우스의 수술 성공률이 크게 높아질 수 있습니다.
Introduction
Sakowitz 등은 1973 년에 처음으로 신장 이식의 마우스 모델을 개발한 이래로 1 년 이식 허혈성 손상 및 동종 면역 거부의 메커니즘을 연구하고 동종 이식편 생존을 연장하고 면역 관용을 달성하기위한 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 실험 도구로 입증되었습니다. 그러나 수술 기술은 복잡하고 매우 까다로운 것으로 입증되었으며, 때로는 전신 비 면역 학적 신장 이식 실패로 이어지는 혈관 해부학 적 협착2, 허혈로 인한 신부전 및 이식 된 요관의 후속 괴사로 인한 신부전, 이식 된 요관의 해부학 및 / 또는 수혜자의 소변 방광의 협착으로 인해 요로 유출의 중단으로 이어지는 합병증이 있습니다. 이 모든 것이 생쥐의 신장 이식이 더 이상 개발되지 않아 널리 사용되지 않는 이유입니다. 혈관 및 요로 합병증 없이 효과적이고 장기간 안정한 마우스 신장 이식 모델을 확립하는 것은 신장 면역 매개뿐만 아니라 감염성 질환에 초점을 맞춘 이식 분야의 많은 연구에서 여전히 대체할 수 없는 의미를 갖는다3. 또한, 폐, 심장 및 장 이식 4,5와 같은 뮤린 모델에서의 다른 장기 이식과 비교하여, 마우스 신장 이식 모델은 주조직 적합성 항원 불균형 3,6의 설정에서도 장기 생존을 연구할 기회를 제공한다. 또한, 공여체-수용자 균주 조합의 동일한 설정에서 심장 또는 신장과 같은 상이한 장기 이식은 동종이식편 거부반응의 상이한 역학 및 발병을 특징으로 하는 것으로 나타났다3. 또한, 신장학적 관점에서, 단순한 피부 이식 실험보다 급성 및 만성 거부 사건의 맥락에서 실질 매개 면역 조절 메카니즘을 연구하는 데 더 적합한 모델이다.
생쥐 3,7,8,9에서 신장 이식의 외과 적 기술에 대한 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 우리 그룹 10,11,12 내에서 지난 10 년 동안 성공적으로 적용된 다음과 같은 신뢰할 수있는 개선을 보여줍니다 : 첫째, 신장 동맥이 절제됨에 따라 요관 동맥이 안전하게 보존됩니다. 복부 대동맥의 각 부분과 함께. 둘째, 해부학의 최종 스티치가 전통적인 접근법처럼 상부 넥타이의 끝과 묶이지 않고 자유롭게 유지되는 매듭없는 혈관 해부학의 새롭고 단순하며 신속한 기술입니다. 이 기술은 신장 재관류 후 아나스토모시스의 크기를 늘리거나 줄여 혈관 협착 및 복강 내 출혈을 피할 수 있습니다. 셋째, 21G 및 30G 주사기 바늘을 보조 천자 안내 도구로 사용하여 기증자 요관을 수용자의 방광 벽에 이식하여 수용자의 방광 손상을 줄이고 엄격하지 않은 문합 형성을 촉진했습니다.
이 보고서에서 우리는 또한 전통적이고 널리 사용되는 기술을 우리 실험실에서 확립 된 수정 된 기술과 비교했으며 신장 관상 위축 및 신장 이식 간질 조직 섬유증의 정도에 큰 차이가 없음을 발견했습니다. 이전 연구에서, 우리는이 새로운 기술의 결과를 국소 출혈, 혈전증, 혈관 해부학 수행 시간 및 생존율 측면에서 기존의 방법과 추가로 비교했습니다. 우리는 국소 혈전증 사건의 현저한 감소 (1.1 % 대 6.6 %), 해부학 적 절차를위한 시간 단축, 재현성이 높은 신장 syngeneic 이식편 장기 생존 (고전적 접근법의 경우 95 % 대 84 %)10과 같은 개선을 발견했습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었습니다 (동물 윤리 카드 : 식품 의약품 안전부의 니어 작센 부, #33.9-42502-04-11/0492). 멸균 수술 도구 및 소모품 (오토클레이브)을 사용하여 절차를 수행하고 수술 영역을 가능한 한 멸균 상태로 유지하십시오.
참고: C57BL/6J 수컷 마우스는 기증자 및 수혜자(syngeneic transplant model)로 사용되었고, Balb/c 마우스는 신장 동종이식편 수용자(급성 동종이식편 거부 모델9를 연구하기 위한 모델)로 사용되었다. 마우스는 8-12주 사이에 숙성되었고, 이식시 ∼25-30 g의 무게를 측정하고, 표준 조건 하에서 수용하였다. 이 원고에보고 된 데이터는 생쥐 수술 경험이 풍부한 네 명의 외과 의사에 의해 생성되었습니다.
1. 준비 단계
- 수술을 위해서는 마이크로 가위, 마이크로 포셉, 바늘 홀더, 미세 지혈 클램프 및 전기 수술 펜을 포함한 현미경 도구 세트를 사용하십시오. 7/0er, 10/0er 또는 4/0er 나일론 모노필라멘트를 사용하여 봉합사를 수행합니다.
- 마취의 경우, 무의식을 유도하기 위해 약 40-60 초 동안 이소플루란 (2 %)을 흡입하기 위해 마우스를 상자에 넣으십시오.
- 마우스가 마취되면 마우스의 무게를 측정하십시오.
- 마우스의 체중에 따라 케타민 (100 mg / kg) + 자일라진 (10 mg / kg) + 아세프로 마진 (2 mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스(13)를 마취하십시오. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 부족한 것을 관찰하여 마우스가 마취되었는지 확인하십시오.
- 마취가 효과가 있으면 복부 모피를 자르십시오. 그런 다음 멸균 마스킹 테이프로 팔다리를 느슨하게 고정시켜 수술대에 마우스를 고정시킵니다.
- 마우스를 수술대에 놓은 후 마우스의 복부를 소독하십시오. 포비돈 요오드화물 (iodophor)과 알코올의 번갈아 가며 소독을 세 번 (동심원 패턴 사용, 복부 중앙에서 스크럽을 시작하고 바깥쪽으로 이동)을 수행 한 다음 fenestated 수술 타월을 사용하여 마우스를 적절하게 드레이프하십시오.
- 눈 연고를 바르고 절차 전반에 걸쳐 불임을 유지하십시오.
참고: 항생제는 이러한 물질이 면역학적 반응에 영향을 미칠 수 있으므로 시술 전반에 걸쳐 권장되지 않습니다.
2. 기증자 운영 절차
- 가위를 사용하여 피부를 자르고 약 3-4cm의 교차 복부 절개를 수행하십시오. 복벽의 근육을 자르십시오. 뚜껑을 덮고 조심스럽게 식염수 주입 거즈로 내장을 옮깁니다.
- 면봉을 사용하여 창자, 위 및 비장을 오른쪽으로 부드럽게 제거하고 (마우스의 관점에서 볼 때) 덮고 식염수 흡수 거즈로 장을 조심스럽게 옮깁니다.
- 마이크로 포셉을 사용하여 왼쪽 신장, 대동맥 및 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.
- 전기 수술 연필을 사용하여 왼쪽 요추 정맥을 소작하십시오., 그들의 근본적인 가지 및 왼쪽 부신 혈관과 함께 다른 작은 혈관을 포함하여, 조심스럽게 소작하십시오.
- 마이크로 가위와 포셉을 사용하여 왼쪽 요관을 해부하고 조심스럽게 주변 조직에서 동원하십시오. 깨끗이 비뇨기 방광에 가깝게 잘라. 길이가 약 2mm 인 왼쪽과 오른쪽 신장 동맥 사이의 대동맥 영역을 동원하십시오.
- 마이크로 포셉을 사용하여 infrarenal inferior vena cava (IVC)와 대동맥을 분리 한 다음 곡선 포셉을 사용하여이 용기 주위에 7-0 실크 봉합사의 느슨한 넥타이를 배치하십시오.
- 두 개의 5mm 미세혈관 클램프를 사용하여 오른쪽 신장 동맥과 열등한 정맥 카바 (IVC) 아래의 대동맥 영역을 크로스 클램프합니다.
- 베나 카바에서 왼쪽 신장 정맥을 횡단하십시오.
- 주사기를 사용하여 대동맥을 헤파린 식염수 1mL(60U/mL)로 세척합니다.
- 마이크로 포셉을 사용하여 단계 2.5에서 적용된 합자를 조이십시오. 그런 다음 대동맥을 합자 아래뿐만 아니라 근위 클램프 아래로 자릅니다. 이것으로, 신장 동맥의 근위 분기 (동맥 개구부는 깔끔하게 절단되어야하며, 그렇지 않으면 해부학에 영향을 미칠 것입니다)와 요관 동맥이 포함되고 횡단 됩니다. 섬세한 요관 동맥이 완전히 보존되도록 조심스럽게 준비하십시오.
- 전기 수술 연필과 포셉을 사용하여 모든 혈관 주변 조직을 조심스럽게 소작하여 왼쪽 신장과 관련 혈관을 완전히 풀어줍니다. 신장을 제거하고 4 °C의 식염수에 보관하십시오.
- 마취된 기증자 마우스를 감금에 의해 안락사시킨다.
3. 수신자 조작 절차
- 공여체 마우스에 대해 기재된 바와 같이 초기 수술 단계(마취 및 멸균 포함, 단계 1.1 내지 1.7 참조)를 수행한다.
- 가위를 사용하여 중간 절개 (길이 약 2.5cm)를 통해 복부를 연 다음 식염수를 사용하여 젖은 거즈로 복부 장기를 덮으십시오.
- 조심스럽게 infrarenal 대동맥과 열등한 정맥 카바 (IVC)를 보존하고 모든 대형 혈관 가지가 소작되었는지 확인하십시오. 전기 소작을 사용하여 신장 골반에 가까운 위치에서 왼쪽 요관을 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 왼쪽 신장을 제거하십시오.
- 마이크로 포셉과 면봉을 사용하여 복부 대동맥과 열등한 정맥 카바를 노출시키고 주변 지방 조직 (길이 약 4mm 이상)에서 분리하십시오.
- 두 개의 미세 혈관 클램프를 사용하여 열등한 정맥 카바와 복부 대동맥에 동시에 근접 및 원위 방향으로 배치하십시오.
- 마이크로 니들 홀더를 사용하여 10/0 모노필라멘트(매끄러운 표면을 가진 합성 섬유로 제조됨) 봉합사 바늘을 안내하고, 이는 대동맥 벽을 통해 근위-원위 방식으로 배치된다.
- 봉합사의 부드러운 상향 견인력으로 약 1mm의 타원형 동맥 절제술을 달성하고 미세하고 구부러진 가위로 바늘의 아래쪽 얼굴 바로 아래를 절단하십시오.
- 마이크로 가위를 사용하여 약 1.5mm의 충분한 길이로 열등한 베나 카바 (IVC)를 세로로 자릅니다. 이 절개를 대동맥 아래 약간 아래에 놓습니다.
- 기증자 및 수혜자 대동맥 해부학을 종단 간 방식으로 수행하십시오. 기증자 신장을 수혜자의 열등한 정맥 카바 오른쪽에 놓고 기증자의 복부 대동맥의 커프를 수혜자의 복부 대동맥의 해부학과 일치시킵니다.
- 마이크로 바늘 홀더와 두 개의 분리 된 10-0 봉합사를 사용하여 아나스토마증의 근위 및 원위 끝을 스티치하십시오.
- 묶은 후 바늘을 포함한 두 개의 긴 봉합사를 제자리에 두십시오. 해부학의 대동맥 벽의 왼쪽을 원위 - 근위 방향으로 두 개의 고르게 이격 된 바늘로 지속적으로 바느질하십시오.
- 마지막 스티치 후, 상부 스테이 봉합사 타이 위의 용기 벽의 부분 두께를 통해 봉합사를 안내하십시오.
- 마이크로 포셉을 사용하여 하부 봉합사 타이의 짧은 끝까지 부드러운 견인력을 동시에 발휘하십시오.
참고 :이 새로운 매듭없는 기술에서 마지막 스티치는 상단 타이의 짧은 끝에 묶여 있지 않습니다. - 마이크로 포셉을 사용하여 이식 된 신장을 정상 위치로 뒤집으십시오. 이제 대동맥 해부학의 오른쪽 벽을 근위부터 원위 방향으로 세 개의 바늘을 사용하여 지속적으로 바느질하십시오.
참고 : 기존의 수술 기술 7,8과 비교하여 마지막 봉합사는 근처의 원위 넥타이와 병합됩니다. 하부 봉합사의 끝에 묶지 말고 대신 2-3mm의 자유 길이를 남기도록 자릅니다. - 앞에서 설명한 것과 동일한 봉합 절차를 사용하여 정맥 해부학을 수행하고 아나스토마증의 각 측면에 네 개에서 다섯 개의 바늘이 필요하다는 차이점이 있습니다. 최종 스티치는 위에서 설명한 대동맥 해부학과 유사한 유사한 길이의 자유 단부로 남습니다.
- 두 해부학을 모두 완료 한 후 마른 면봉을 사용하여 봉합 된 부위쪽으로 약 10-20 초 동안 부드러운 압력을 가하십시오.
- 클립 어플리케이터 포셉을 사용하여 두 클램프를 모두 제거하고, 먼저 아래쪽과 위쪽을 제거합니다. 복강을 38.0°C의 온도에서 0.9% 염화나트륨으로 헹구십시오.
- 이식 된 신장의 재관류를 관찰하십시오.
4. 요관 이식
- 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 10/0 봉합사 (직선 바늘)로 수용자의 소변 방광을 관통하고 지침을 위해 21G 바늘 루멘에 삽입하십시오 ( 보충 그림 1a 참조).
- 이제 21G 바늘을 안내하여 이전 바늘 적용 장소에 구멍을 뚫습니다 (보충 그림 1b).
- 21G 바늘을 꺼냅니다(보충 그림 1c).
- 마이크로 바늘 홀더와 10/0 봉합사를 사용하여 트리밍된 요관 끝을 스티치(넥타이 없음)하고 입구 위치에서 이 10/0 봉합사로 방광을 다시 천공합니다(보충 그림 1d).
- 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 10/0 필라멘트와 요관을 구성된 구멍을 통해 소변 방광으로 견인하십시오 (보충 그림 1e).
- 마이크로 바늘 홀더와 다른 10/0 봉합사를 사용하여 기증자의 요관을 수혜자의 소변 방광으로 해부학적으로 분석하십시오. 여기서 요관의 외막을 방광 벽의 외막에 연결하고 3 ~ 4 개의 바늘로 간헐적 봉합사를 수행하십시오. 마지막으로 견인 봉합사를 꺼냅니다 (보충 그림 1f).
- 포셉을 사용하여 내장을 복강에 다시 넣으십시오. 4/0 필라멘트를 사용하여 복부 상처를 닫기 위해 2 층 봉합사 (먼저 복부 근육 다음에 피부)를 수행하십시오.
- 이식된 마우스를 수술 후 회복을 위해 산소 및 온도 조절된 챔버에 넣는다.
- 수술 후 진통제의 경우, 수술 후 Metamizol에게 os 당 200 mg / kg을 직접 투여하십시오.
수술 후 4 시간 및 16 시간은 Metamizol에게 os 당 200 mg / kg과 Carprofen (5mg / kg) s.c를 제공합니다. 추가 후속 조치에서 Carprofen (5 mg / kg) s.c.를 수술 후 3 일 연속 24 시간마다 이식 된 마우스에 바르십시오13. 불충분 한 진통의 징후가있는 경우 buprenorphine 0.05 mg / kg은 8 h s.c마다 추가로 제공됩니다.
5. 수용자 마우스의 대측성 신장절제술 및 희생
참고: 이식 후 5일 후에 수용자 마우스의 대측성 신장절제술을 시행하십시오.
- 이식 후 이식 5일 후에 이식된 마우스의 대측성 신장절제술을 마취하에 수행한다. 수용자의 자가 우측 신장 동맥과 정맥을 Ligate하고 자르고, 오른쪽 신장을 제거하고 복강을 닫습니다. 수술 후 치료 및 진통제는 이전에 기술된 바와 동일하다(단계 4.7 참조).
- 마우스의 상태를 올리고 기록합니다. 이식 된 마우스에게 수술 후 진통제, 음식 및 물 공급을 제공하십시오.
- 이식 후 사주 후, 이식된 마우스의 절반을 희생시키고 신장 이식을 위해 H&E 염색을 수행합니다.
- 이식 12주 후, 남아있는 마우스를 희생시키고 이들 신장 이식의 Masson Gold 염색을 수행한다.
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Representative Results
이식 4주 후, 변형된 기술 뿐만 아니라 종래의 기술 둘 다 천연 수용자 대측성 신장과 비교했을 때 신장 세뇨관 위축의 중간 징후 14,15를 나타내었다(도 1). 신장 세뇨관 위축의 정도는 두 가지 다른 기술 사이에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다. 매슨 골드너의 삼색 염색 12주 후 신장의14,15개는 이식되지 않은 정상 신장과 비교했을 때 간질성 조직 섬유증의 명백한 징후를 균일하게 나타냈다(도 2).
우리는 이전에이 새로운 매듭없는 기술 (n = 175)의 결과를 조사하고 절차 및 수술 중 및 수술 후 합병증의 기술적 측면 측면에서 고전적인 접근법 (n = 122)과 비교했습니다 ( 표 1 참조) 10. 여기에 나타낸 변형된 기술은 이식내 동맥 또는 정맥 혈전 사건의 더 낮은 발생과 관련되었다(도 3b, 1.1% 대 6.6%). 해부학을 수행하는 시간은 상당히 적었고(도 3a), 이식 후 12주 후에 수용자 생존에 의해 결정된 바와 같이 재현성이 높은 신장 이식편 장기 생존(95% 대 84%, p< 0.001, 도 3c)이 달성되었다. 또한, 이러한 변형된 이식 절차의 적용은 12주10주의 관찰 기간 동안 혈청 크레아티닌에 의해 평가된 바와 같이 신장 동종이식편 기능에 영향을 미치지 않는다.
| 진부한 | 새로운 매듭없는 기술 | |
| (n=122) | (n=175) | |
| 작동 시간 | ||
| 동맥 해부학 시간 (분) | 9.2 ± 0.09 | 7.5 ± 0.06** |
| 정맥 해부학을위한 시간 (분) | 9.1 ± 0.10 | 7.5 ± 0.05** |
| 합병증 비율 | ||
| 혈전증 | 8 (6.6%) | 2 (1.1%)* |
| 국소 출혈 | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| 성공률 | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong, S., Lewis AG., Kunter U., et al. 마우스의 신장 이식을위한 매듭없는 기술. J 이식. Epub2012:127215,(2012). | ||
표 1: 이 새로운 기술 (n = 175)과 수술 후 합병증 (n = 122)의 기술적 측면 및 수술 후 합병증10의 관점에서 비교. 숫자는 각 절차의 작업 시간(분)을 나타냅니다(평균 ± SD).
그림 1: 관상 위축을 평가하는 대표적인 조직학적 결과. 이식 4주 후 신장 이식의 HE 염색 (40x): (a) 정상 이식되지 않은 신장, (b) 통상적인 기술, 및 (c) 합성된 신장 이식의 변형된 기술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 간질성 섬유증을 평가하는 대표적인 조직학적 결과. Masson Goldner의 삼색 염색은 (a) 정상 이식되지 않은 신장, (b) 통상적인 기술, 및 (c) 합성 신장 이식의 변형 기술의 이식 12주 후(40x)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 혈관 해부학의 작동 시간, 합병증의 빈도 및 변형 및 종래의 기술 사이의 성공률의 비교 (10) (a)의 막대 그래프는 혈관 해부학을 수행하는 데 필요한 작동 시간을 묘사한다. (b)의 막대 그래프는 이식 내 혈전증 사건 및 국소 출혈 문제를 묘사하고; 반면 (c)의 막대 그래프는 천연 대측성 신장의 추가 이식 후 이식 후 12 주 이상 생존에 따른 새로운 매듭없는 기술의 더 높은 성공률을 입증합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 해부학적 구조(상부 패널 a 및 b) 및 대동맥 및 신장 동맥의 절제선 둘 다에 대한 통상적인 (c) 및 변형된 기술 (d). ( A) 복부 대동맥, (B) 신장 동맥, (C) 요관 동맥, (D) 신장, (E) 요관의 개요. 정맥 혈관 (V. 카바, Vv. renales를 포함)은 점선으로 묘사됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 동맥 혈관의 매듭없는 바느질의 예시적인 시연은 (A) 복부 대동맥, (B) 신장 동맥, 및 (C) 아나스토모시스의 마지막 스티치가 묶이지 않는 매듭없는 바느질 기술을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 수혜자의 소변 방광이있는 기증자 요관의 해부학. (a) 10/0 모노필라멘트로 수용자의 방광을 관통하여 21G 바늘의 내강에 삽입하고, (b) 21G 바늘을 안내하여 이전 바늘 천공에 위치한 구멍을 수행하고, (c) 21G 바늘을 꺼내고, (d) 10/0 봉합사로 손질된 요관 끝을 꿰매고, 진입 장소에서 10/0 봉합사로 방광을 다시 천공하고, (e) 그런 다음, 10/0 봉합사와 요관을 구성된 구멍을 통해 소변 방광으로 견인하고, (f) 다른 10/0 봉합사로 수혜자의 방광에 기증자의 요관을 해부학적으로 분석한다. 마지막으로, 견인 봉합사를 꺼냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스에서의 피부 이식 모델은 동종이면역 거부 사건을 연구하기 위해 간단하고 수행하기 쉬운 반면, 심장(16 ) 및 신장 이식(10 ) 후 동종암 관련 염증 변화를 보다 구체적으로 조사하기 위한 수술 기술은 복잡하고 매우 요구되는 것으로 입증되었다. 이식 신장 전문의의 관점에서 볼 때, 효과적이고 장기간 안정적인 마우스 신장 이식 모델의 확립은 많은 기능적 및 면역 학적 연구에서 여전히 대체 할 수없는 중요성을 가지고 있습니다. 또한, 다른 장기 이식과 비교하여, 마우스 신장 이식 모델은 주조직 적합성 항원의 특정 차이에도 불구하고 장기간 생존을 달성할 수 있으며, 이는 거부반응의 장기 개발 또는 동종이암 내성을 확립하기 위한 전제 인자의 동정 둘 다의 장기 개발에서 면역 조절 기작을 연구할 기회를 암시한다3.
앞서 설명한 바와 같이, 생쥐의 신장 이식은 어려운 절차이며, 경험 많은 외과 의사조차도 40 ~ 95 % 10,17,18,19,20 사이에서 매우 다양합니다. 이 수술 기술에 대한 전 세계 다양한 연구팀의 보고서와 관련하여 우리는 몇 가지 개선으로 이어지는 고전적인 접근 방식과 비교하여 다음과 같은 수정을했습니다.
먼저, 복부 대동맥의 패치를 절단하고 기증자 신장 엔블럭을 포함한 신장 동맥 및 요관 동맥의 근위 분기가 횡단되도록 준비한다. 이 기동은 주변 요관 조직의 손상을 피함으로써 기증자의 혈액 공급과 기능을 완전히 보존하고 유지하여 수술 후 수두증을 예방할 뿐만 아니라 신장 동맥의 수술 후 협착을 예방합니다(그림 4). 따라서, 신장 이식은 신장 동맥의 협착에 의해 매개되거나 엄격하고 허혈성 이식 요관에 의해 매개되는 수소화구에 의해 야기되는 허혈은 회피되며, 이 모델에서 장기 이식 생존을 달성하기 위한 두 가지 주요 측면을 나타낸다. 그러나 요관 동맥의 자손에 대한 해부학 적 변형이 있습니다. 예를 들어, 일부 마우스에서 요관 동맥은 신장 동맥 대신 복부 대동맥의 주요 줄기에서 유래하며이 자손의 위치는 대부분 신장 동맥의 자손으로부터 약 0.2 ~ 0.5mm 원위입니다 ( 그림 4 참조). 우리의 경험에서, 우리는 C57BL / 6J 수컷 마우스의 약 20 % (미공개 관찰)에서 대동맥에서 직접 기원되는 요관 동맥의 발생을 추정 할 것이며, BALBc와 같은 다른 균주의 마우스에서는 거의 발생하지 않습니다. 보고된 전통적인 수술 방법 중 일부에서, 이 중요한 영양 용기는 무시되고 직접 결찰되거나 전기 소작되기 때문에 때때로 보호에 소홀히 되었다.
특히 마우스의 요관 동맥의 자손이 신장 동맥의 자손 아래의 복부 대동맥의 주요 줄기에서 유래 할 때 해부학 적 변종의 이러한 상황에서 en bloc transection과 대동맥 해부학의 재건의이 방법이 훨씬 더 적합합니다. 숙련 된 외과 의사는 전통적이거나 수정 된 en bloc anastomosis를 언제 사용할지 결정할 수도 있습니다.
둘째, 해부학의 최종 스티치가 전통적인 접근법처럼 위쪽 넥타이의 끝과 묶이지 않고 대신 자유롭게 유지되는 매듭없는 혈관 해부학의 새롭고 간단하며 신속한 기술의 적용은 귀중한 이점을 제공합니다 ( 그림 5 참조). 이 기술은 신장 이식 재관류가 이미 시작된 후에도 해부학의 크기를 늘리거나 줄일 수 있습니다. 이것은 혈관 협착과 복강 내 출혈의 발달을 피합니다. 또한, 양쪽 끝에있는 앵커링 스티치의 자유 꼬리는 반대 방향으로 당겨 동맥이나 정맥의 협착을 피하기 위해 해부학을 유연하게 조정하고 확장 할 수 있습니다. 따라서 스티칭 기술은 수술 내결함성을 향상시키고 초보자(20)에게 친숙합니다.
셋째, 공여체 요관 및 수용자 방광의 무외상성 해부학을 수행하기 위해, 21 G 및 30 G 주사기 바늘을 보조 천자 가이드 도구로 사용하였다. 생쥐에서 요관은 매우 얇고 매우 섬세하여 종단 간 해부학을 수행합니다. 일반적으로 기증자 요관은 주사기 바늘로 방광을 천공 한 후 요관을 안내하기 위해 포셉을 사용하여 방광으로 직접 당겨집니다. 우리는 더 얇은 직경 30 G 주사기 바늘을 21 G 주사기 바늘 (Seldinger 절차)에 대한 가이드로 사용하여이 방법을 더욱 개선했습니다. 이러한 외상성 기술을 통해 21G 주사기 바늘이 방광 전체에 침투하지 않아 방광의 손상과 요관 이식의 어려움을 감소시킵니다(보충 그림 1).
프로토콜의 중요한 단계는 동맥 개방의 구성입니다. 두 경우 모두 (기증자와 수혜자) 이들은 깔끔하게 절단되어야하며, 그렇지 않으면 문합 술의 질에 영향을 미칩니다. 또한,이 새로운 매듭없는 기술에서, 마지막 스티치는 매듭 된 실에 묶여 있지 않습니다. 문합 후 외과 의사는 처음에는 해부학 적 스토마를 작게 유지해야합니다. 그런 다음 재관류 후 실의 끝을 위쪽과 아래쪽 끝에서 당겨 확대하십시오. 알아야 할 또 다른 중요한 단계는 요관 동맥이 보호되기 위해 확인되어야하기 때문에 기증자 신장 동맥의 절개 위치입니다.
이 기술의 주요 한계는 설명 된 개선 사항 외에도 선박 벽이 작고 매우 부드럽기 때문에 운영자가 여전히 높은 요구 사항을 충족해야한다는 것입니다. 강렬하고 끈기 있는 연습이 없다면 수술 성공률은 낮을 것입니다.
요약하면,이 보고서는 마우스에서 신장 이식 절차의 기술적 변형의 적용 가능성을 보여줍니다. 여기에 제시된 수술 절차는 지난 10 년 동안여러 연구 간행물의 필수 구성 요소 역할을했던 가치 있고 신뢰할 수있는 방법으로 입증되었습니다 3,19,20. 고전적이고 널리 확립 된 수술 모델과 비교할 때, 여기에서 입증 된 방법은 합성 신장 이식 설정3에서 합병증 발생률이 적고 이식 생존율이 길어지는 몇 가지 중요한 개선을 제공합니다. 두 기술 (수정 및 기존)은 내장 손상, 소변 누출, 수로 신증, 감염 등과 같은 수혜자의 사망률에 영향을 미치는 동일한 추가 합병증을 공유한다는 것을 언급하는 것이 중요합니다. 요약하면,이 새로운 수술 기술은 전반적인 성공률과 장기 이식 생존율을 향상시켜 신장 이식 후 동종 면역 반응을 연구하는 신뢰할 수있는 도구입니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
우리는 Tiantian Bai 박사 팀이 음성 오버에 도움을 주신 것에 대해 감사 드리며, Mian Pao 양은 의료 일러스트레이션에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 국제 협력 (AH에 HO2581 / 4-1)과 중국 국립 과학 재단 (NSFC; FJ에 #81760291)을 촉진하기 위해 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
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