Summary
Dieses Protokoll stellt eine neue chirurgische Technik der Nierentransplantation von Mäusen vor, die sich auf eine modifizierte Strategie der arteriellen Anastomose konzentriert. Eine vaskuläre Nahttechnik, einschließlich einer einfachen und sichereren Harnleiter-Blasen-Anastomose-Methode, wird ebenfalls vorgestellt. Diese Modifikationen verkürzen die Operationszeit und verbessern die Erfolgsquote der Nierentransplantation der Maus.
Abstract
Die Nierentransplantation bei Mäusen ist ein kompliziertes und herausforderndes chirurgisches Verfahren. Es gibt nur sehr wenige Publikationen, die die wichtigsten Schritte dieser Operation aufzeigen. Daher stellt dieser Artikel die Technik vor und weist auf die chirurgischen Vorbehalte hin, die mit dieser Operation verbunden sind. Darüber hinaus werden wichtige Modifikationen im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren aufgezeigt. Zunächst wird ein Fleck der Bauchaorta geschnitten und so präpariert, dass die proximalen Bifurkationen der Nierenarterie, einschließlich der Harnleiterarterie, zusammen mit der Spenderniere en bloc transktiert werden. Dies reduziert das Risiko einer Harnleiternekrose und vermeidet die Entwicklung eines Harnwegsverschlusses. Zweitens wird eine neue Methode der vaskulären Anastomose demonstriert, die es dem Bediener ermöglicht, die Größe der Anastomose flexibel zu erhöhen oder zu verringern, nachdem die Nierentransplantationsreperfusion bereits eingeleitet wurde. Dies vermeidet die Entwicklung von Gefäßverengungen und intraabdominalen Blutungen. Drittens wird eine Technik gezeigt, die die Anastomose des empfindlichen Spenderharnleiters und der Empfängerblase ermöglicht, die kein Trauma verursacht. Die Einführung dieses Protokolls kann die Operationszeit verkürzen und die Schädigung der Blase des Empfängers reduzieren, wodurch die Operationserfolgsrate für die Empfängermäuse erheblich erhöht wird.
Introduction
Seit Sakowitz et al. 1973 zum ersten Mal Mausmodelle der Nierentransplantation entwickelten 1, hat es sich als wichtiges experimentelles Werkzeug erwiesen, um die Mechanismen der ischämischen Transplantationsverletzung und der alloimmunen Abstoßung zu untersuchen sowie neue Behandlungen zu entwickeln, die darauf abzielen, das Überleben des Allotransplantats zu verlängern und möglicherweise eine immunologische Toleranz zu erreichen. Die Operationstechnik hat sich jedoch als komplex und sehr anspruchsvoll erwiesen und weist manchmal Komplikationen wie vaskuläre anastomotische Strikturen auf, die zu prärenalem nicht-immunologischem Nierentransplantatversagen2 führen, postrenales Versagen durch Ischämie und anschließende Nekrose des transplantierten Harnleiters, Einschränkungen der Anastomose des transplantierten Harnleiters und / oder der Urinblase des Empfängers, die zu einer Störung des Harnabflusses führen. All dies sind Gründe, warum die Nierentransplantation bei Mäusen nicht weiterentwickelt wurde und daher nicht weit verbreitet ist. Die Etablierung eines effektiven und langzeitstabilen Mausnierentransplantationsmodells ohne Gefäß- und Harnwegskomplikationen hat für viele Studien im Transplantationsbereich mit Fokus auf die renalen immunvermittelten aber auch Infektionskrankheiten noch unersetzliche Bedeutung3. Darüber hinaus bietet das Nierentransplantationsmodell der Maus im Vergleich zu anderen Organtransplantationen in murinen Modellen wie Lungen-, Herz- und Darmtransplantation 4,5 eine Chance, das Langzeitüberleben auch unter dem Setzen einer großen Histokompatibilitätsantigendisparitätzu untersuchen 3,6. Es wurde auch gezeigt, dass in der gleichen Umgebung von Spender-Empfänger-Stammkombinationen verschiedene Organtransplantationen wie Herz oder Niere durch unterschiedliche Dynamiken und Auslöser der Allotransplantatabstoßunggekennzeichnet sind 3. Darüber hinaus ist es aus nephrologischer Sicht ein geeigneteres Modell für die Untersuchung parenchymalvermittelter Immunregulationsmechanismen im Kontext akuter und chronischer Abstoßungsereignisse als einfache Hauttransplantationsexperimente.
Auf der Grundlage früherer Berichte über die Operationstechnik der Nierentransplantation bei Mäusen 3,7,8,9 zeigen wir hier die folgenden zuverlässigen Verbesserungen, die in den letzten 10 Jahren in unserer Gruppe 10,11,12 erfolgreich angewendet wurden: Erstens wird die Harnleiterarterie sicher konserviert, da die Nierenarterie en bloc reseziert wird zusammen mit dem jeweiligen Teil der Bauchaorta. Zweitens eine neue, einfache und schnelle Technik einer knotenlosen vaskulären Anastomose, bei der der letzte Stich der Anastomose nicht wie der traditionelle Ansatz mit dem Ende der oberen Bindung verbunden ist, sondern frei bleibt. Diese Technik ermöglicht es, die Größe der Anastomose nach der renalen Reperfusion zu erhöhen oder zu verringern, um Gefäßverengungen und intraabdominale Blutungen zu vermeiden. Drittens wurden 21 G und 30 G Spritzennadeln als zusätzliches Einstichführungswerkzeug verwendet, um den Spenderharnleiter in die Blasenwand des Empfängers zu implantieren, wodurch die Schädigung der Blase des Empfängers verringert und die Bildung einer strikturfreien Anastomose erleichtert wurde.
In diesem Bericht verglichen wir auch die traditionelle, weit verbreitete Technik mit der modifizierten, die in unserem Labor etabliert ist, und fanden keinen signifikanten Unterschied im Grad der renalen tubulären Atrophie und der interstitiellen Gewebefibrose der Nierentransplantation. In früheren Studien haben wir die Ergebnisse dieser neuen Technik zusätzlich mit der herkömmlichen Methode in Bezug auf lokale Blutungen, Thrombosen, Zeit für die Durchführung der Gefäßanastomose und Überlebensrate verglichen. Wir fanden Verbesserungen wie eine signifikante Reduktion lokaler Thromboseereignisse (1,1% gegenüber 6,6%), eine verkürzte Zeit für das Anastomoseverfahren und ein hochgradig reproduzierbares Langzeitüberleben des syngenen Nierentransplantats (95% gegenüber 84% mit dem klassischen Ansatz)10.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz von Tieren durchgeführt, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (Tierethikkarte: Niedersächsisches Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit, #33.9-42502-04-11/0492). Führen Sie Verfahren mit sterilen chirurgischen Instrumenten und Verbrauchsmaterialien (autoklaviert) durch und versuchen Sie, den Operationsbereich so steril wie möglich zu halten.
HINWEIS: C57BL/6J männliche Mäuse dienten als Spender und Empfänger (syngenes Transplantationsmodell), während Balb / c-Mäuse als Nierenallotransplantatempfänger dienten (Modell zur Untersuchung der akuten Allotransplantatabstoßung Modell9). Die Mäuse waren zwischen 8-12 Wochen alt, wogen bei der Transplantation ~ 25-30 g und wurden unter Standardbedingungen untergebracht. Die in diesem Manuskript berichteten Daten wurden von vier Chirurgen generiert, die Erfahrung in der Mäusechirurgie haben.
1. Vorbereitende Schritte
- Verwenden Sie für die Operation eine Reihe von mikroskopischen Instrumenten, einschließlich einer Mikroschere, einer Mikropinzette, eines Nadelhalters, mikrohämostatischer Klemmen und eines elektrochirurgischen Stifts. Führen Sie Nähte mit 7/0er, 10/0er oder 4/0er Nylonmonofilament durch.
- Für die Anästhesie, legen Sie die Maus in die Box zum Einatmen von Isofluran (2%) für etwa 40-60 s, um Bewusstlosigkeit zu induzieren.
- Sobald die Maus betäubt ist, wiegen Sie die Maus.
- Je nach Gewicht der Maus eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) + Xylazin (10 mg/kg) + Acepromazin (2 mg/kg) zur Betäubung der Maus13 auftragen. Bestätigen Sie, dass die Maus betäubt ist, indem Sie eine mangelnde Reaktion auf eine Zehenzwicke beobachten.
- Wenn die Anästhesie wirksam geworden ist, schneiden Sie das Bauchfell ab. Fixieren Sie dann die Maus auf dem Operationstisch, indem Sie die Gliedmaßen mit einem sterilen Abdeckband locker immobilisieren.
- Desinfizieren Sie den Bauch der Maus, nachdem Sie die Maus auf den Operationstisch gelegt haben. Führen Sie eine Desinfektion mit abwechselndem Peeling von Povidoniodid (Iodophor) und Alkohol dreimal durch (verwenden Sie ein konzentrisches Muster, beginnen Sie mit dem Peeling in der Mitte des Abdomens und bewegen Sie sich nach außen) und drapieren Sie die Maus dann ordnungsgemäß mit einem fenestrierten chirurgischen Handtuch.
- Tragen Sie Augensalbe auf und bewahren Sie die Sterilität während des gesamten Eingriffs.
HINWEIS: Antibiotika werden während des gesamten Verfahrens nicht empfohlen, da diese Substanzen die immunologischen Reaktionen beeinflussen können.
2. Verfahren für die Operation des Spenders
- Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu schneiden und führen Sie einen Kreuzbauchschnitt von ca. 3-4 cm durch. Schneiden Sie die Muskeln der Bauchdecke ab. Bedecken und entfernen Sie vorsichtig die Eingeweide mit einer salzhaltigen Gaze.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Darm, den Magen und die Milz vorsichtig in Richtung der rechten Seite (aus der Sicht der Maus) zu entfernen, bedecken und bewegen Sie die Eingeweide vorsichtig mit einer salzhaltigen Gaze weg.
- Verwenden Sie eine Mikrozange, um die linke Niere, die Aorta und die untere Hohlvene (IVC) freizulegen.
- Verwenden Sie einen elektrochirurgischen Bleistift, um die linken Lendenvenen, einschließlich ihrer darunter liegenden Äste und anderer kleiner Gefäße zusammen mit dem linken Nebennierengefäß, vorsichtig zu kauterisieren.
- Verwenden Sie Mikroscheren und Pinzetten, um den linken Harnleiter zu sezieren und vorsichtig aus dem umgebenden Gewebe zu mobilisieren. Schneiden Sie es sauber in der Nähe der Harnblase ab. Mobilisieren Sie die Aortenregion zwischen den linken und rechten Nierenarterien von etwa 2 mm Länge.
- Verwenden Sie eine Mikropinzette, um die infrarenale untere Vena cava (IVC) und die Aorta zu trennen, und verwenden Sie dann eine gekrümmte Pinzette, um unter die Aorta zu gehen, um eine lose Krawatte aus 7-0-Seidennaht um dieses Gefäß zu legen.
- Kreuzklemmen Sie den Bereich der Aorta unterhalb der rechten Nierenarterie und der Vena cava inferior (IVC) mit zwei 5 mm Mikrovaskulärklemmen.
- Transsektieren Sie die linke Nierenvene aus der Vena cava.
- Verwenden Sie eine Spritze, um die Aorta mit 1 ml Heparin-Kochsalzlösung (60 E/ml) zu spülen.
- Verwenden Sie eine Mikrozange, um die in Schritt 2.5 angewendete Ligatur festzuziehen. Schneiden Sie dann die Aorta sowohl unterhalb der Ligatur als auch unterhalb der proximalen Klemme ab. Dabei werden die proximalen Verzweigungen der Nierenarterie (bitte beachten Sie, dass die arterielle Öffnung ordentlich geschnitten werden muss, da sonst die Anastomose beeinträchtigt wird) und die Harnleiterarterie eingeschlossen und en bloc transektiert. Bereiten Sie sich sorgfältig vor, damit die empfindliche Harnleiterarterie vollständig erhalten bleibt.
- Verwenden Sie den elektrochirurgischen Bleistift und die Pinzette, um die linke Niere und die zugehörigen Gefäße vollständig zu befreien, indem Sie vorsichtig alle Gefäße kauterisieren, die das Gewebe umgeben. Entfernen Sie die Niere und lagern Sie sie in Kochsalzlösung bei 4 °C.
- Euthanasieren Sie die betäubte Spendermaus durch Enthauptung.
3. Verfahren für die Bedienung des Empfängers
- Führen Sie die ersten chirurgischen Schritte (einschließlich Anästhesie und Sterilisation, siehe Schritte 1.1 bis 1.7) wie für die Spendermaus beschrieben durch.
- Verwenden Sie eine Schere, um den Bauch über einen mittleren Schnitt (etwa 2,5 cm lang) zu öffnen, und bedecken Sie dann die Bauchorgane mit einer feuchten Gaze mit Kochsalzlösung.
- Bewahren Sie die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene (IVC) sorgfältig auf und stellen Sie sicher, dass jeder große Gefäßzweig kauterisiert ist. Verwenden Sie auch die elektrische Kauterisation, um den linken Harnleiter vorsichtig an einer Position proximal zum Nierenbecken zu sezieren. Entfernen Sie dann die linke Niere.
- Verwenden Sie Mikropinzetten und Wattestäbchen, um die Bauchaorta und die untere Hohlvene freizulegen und sie vom umgebenden Fettgewebe (ca. über 4 mm lang) zu lösen.
- Verwenden Sie zwei mikrovaskuläre Klemmen und positionieren Sie sie proximal und distal sowohl auf der unteren Hohlvene als auch auf der Bauchaorta.
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter, um eine 10/0 monofile (aus synthetischer Faser mit glatter Oberfläche) Nahtnadel zu führen, die proximal zu distal durch die Aortenwand platziert wird.
- Erreichen Sie eine elliptische Arteriotomie von ca. 1 mm mit einer sanften Aufwärtsbewegung der Naht, während Sie mit einer feinen, gebogenen Schere direkt unter der unteren Nadelfläche schneiden.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um die untere Hohlvene (IVC) in Längsrichtung mit einer ausreichenden Länge von ca. 1,5 mm zu schneiden. Positionieren Sie diesen Schnitt leicht unter seinem Aortengegenstück.
- Führen Sie die Aorta-Anastomose des Spenders und des Empfängers in einer End-to-Side-Weise durch. Legen Sie die Spenderniere auf die rechte Seite der unteren Hohlvene des Empfängers und richten Sie die Manschette der Bauchaorta des Spenders mit der Anastomose der Bauchaorta des Empfängers aus.
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und zwei separate 10-0-Nähte, um die proximalen und distalen Enden der Anastomose zu nähen.
- Lassen Sie nach dem Binden die beiden langen Nähte, einschließlich der Nadel, an Ort und Stelle. Nähen Sie die linke Seite der Aortenwand der Anastomose kontinuierlich mit zwei gleichmäßig verteilten Stichen in distal-proximaler Richtung.
- Nach dem letzten Stich führen Sie die Naht durch eine teilweise Dicke der Gefäßwand über der oberen Bleibnähte.
- Verwenden Sie Mikrozangen, um gleichzeitig sanfte Traktion bis zum kurzen Ende der unteren Nahtbindung auszuüben.
HINWEIS: Bei dieser neuen knotenlosen Technik ist der letzte Stich nicht an das kurze Ende der oberen Bindung gebunden. - Verwenden Sie eine Mikrozange, um die transplantierte Niere in ihre normale Position zu bringen. Nähen Sie nun kontinuierlich die rechte Wand der Aortenanastomose mit drei Stichen proximal bis distal.
HINWEIS: Im Vergleich zur herkömmlichen Operationstechnik 7,8 wird die letzte Naht mit der distalen Krawatte in der Nähe verschmolzen. Binden Sie es nicht an das Ende der unteren Naht, sondern schneiden Sie es ab, um stattdessen eine freie Länge von 2-3 mm zu erhalten. - Führen Sie die venöse Anastomose mit dem gleichen Nahtverfahren wie zuvor beschrieben durch, mit dem Unterschied, dass für jede Seite der Anastomose vier bis fünf Stiche erforderlich sind. Der letzte Stich wird als freies Ende von ähnlicher Länge ähnlich der oben beschriebenen Aortenanastomose belassen.
- Nachdem Sie beide Anastomosen abgeschlossen haben, verwenden Sie einen trockenen Tupfer, um für etwa 10-20 s einen sanften Druck auf den vernähten Bereich auszuüben.
- Verwenden Sie eine Clip-Applikator-Pinzette, um beide Klemmen zu entfernen, zuerst die untere, dann die obere. Die Bauchhöhle mit 0,9% Natriumchlorid bei einer Temperatur von 38,0 °C abspülen.
- Beobachten Sie die Reperfusion der transplantierten Niere.
4. Harnleiterimplantation
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter, um mit einer 10/0-Naht (gerade Nadel) durch die Urinblase des Empfängers einzudringen, und führen Sie sie zur Orientierung in ein 21-G-Nadellumen ein (siehe Ergänzende Abbildung 1a).
- Führen Sie nun die 21 G Nadel, um ein Loch an der Stelle der vorherigen Nadelapplikation zu nähen (Ergänzende Abbildung 1b).
- Ziehen Sie die 21 G Nadel heraus (Ergänzende Abbildung 1c).
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine 10/0-Naht, um das beschnittene Harnleiterende zu nähen (ohne Krawatte) und perforieren Sie die Blase mit dieser 10/0-Naht erneut an der Eintrittsstelle (Ergänzende Abbildung 1d).
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter, um das 10/0-Filament und den Harnleiter durch das konstruierte Loch in die Urinblase zu schleppen (Ergänzende Abbildung 1e).
- Verwenden Sie einen Mikronadelhalter und eine weitere 10/0-Naht, um den Harnleiter des Spenders an die Urinblase des Empfängers zu anastomosieren. Verbinden Sie hier die äußere Membran des Harnleiters mit der äußeren Membran der Blasenwand und führen Sie intermittierende Nähte mit 3 bis 4 Stichen durch. Ziehen Sie schließlich die Zugnaht heraus (Ergänzende Abbildung 1f).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm wieder in die Bauchhöhle zu legen. Führen Sie zweischichtige Nähte durch (zuerst die Bauchmuskeln, gefolgt von der Haut), um die Bauchwunde mit einem 4/0-Filament zu schließen.
- Legen Sie die transplantierten Mäuse in eine sauerstoff- und temperaturkontrollierte Kammer, um sich nach der Operation zu erholen.
- Bei postoperativer Analgesie geben Sie Metamizol direkt 200 mg / kg pro OS nach der Operation.
Vier und 16 Stunden nach der Operation ergeben Metamizol 200 mg/kg pro OS plus Carprofen (5mg/kg) s.c. In der weiteren Nachuntersuchung wenden Sie Carprofen (5 mg / kg) s.c. alle 24 Stunden an drei aufeinanderfolgenden Tagen nach Operation13 an den transplantierten Mäusen an. Wenn Anzeichen einer unzureichenden Analgesie vorliegen, wird Buprenorphin zusätzlich alle 8 h s.c. 0,05 mg/kg verabreicht.
5. Kontralaterale Nephrektomie und Opfer der Empfängermaus
HINWEIS: Führen Sie 5 Tage nach der Transplantation eine kontralaterale Nephrektomie der Empfängermaus durch.
- Führen Sie die kontralaterale Nephrektomie der transplantierten Maus 5 Tage nach der Transplantation unter Narkose durch. Ligatieren und schneiden Sie die autologen rechten Nierenarterien und Venen des Empfängers ab, entfernen Sie die rechte Niere und schließen Sie die Bauchhöhle. Die postoperative Versorgung und Analgesie sind die gleichen wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 4.7).
- Heben Sie den Zustand der Maus an und zeichnen Sie ihn auf. Stellen Sie der transplantierten Maus postoperative Analgesie, Nahrung und Wasserversorgung zur Verfügung.
- Opfern Sie vier Wochen nach der Transplantation die Hälfte der transplantierten Mäuse und führen Sie eine H & E-Färbung für ihre Nierentransplantationen durch.
- Opfern Sie 12 Wochen nach der Transplantation die verbleibenden Mäuse und führen Sie eine Masson Gold-Färbung dieser Nierentransplantationen durch.
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Representative Results
Vier Wochen nach der Transplantation zeigten sowohl die modifizierte Technik als auch die konventionelle Technik moderate Anzeichen einer renalen tubulären Atrophie14,15 im Vergleich zu den kontralateralen Nieren des nativen Empfängers (Abbildung 1). Der Grad der Nierentubuli-Atrophie zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden verschiedenen Techniken. Masson Goldners trichrome Färbung, die 12 Wochen nach der Transplantation14,15 der Nieren verfärbte, zeigte im Vergleich zu normalen nicht transplantierten Nieren einheitlich offensichtliche Anzeichen einer interstitiellen Gewebefibrose (Abbildung 2).
Wir haben zuvor das Ergebnis dieser neuen knotenlosen Technik (n = 175) untersucht und mit dem klassischen Ansatz (n = 122) in Bezug auf technische Aspekte des Verfahrens und intraoperative und postoperative Komplikationen verglichen (siehe auch Tabelle 1)10. Die modifizierte Technik, die hier gezeigt wird, war mit einem geringeren Auftreten von intratransplantierten arteriellen oder venösen thrombotischen Ereignissen assoziiert (Abbildung 3b, 1,1% gegenüber 6,6%). Die Zeit bis zur Durchführung der Anastomose war signifikant kürzer (Abbildung 3a), und ein hochgradig reproduzierbares Langzeitüberleben des Nierentransplantats wurde erreicht (95% gegenüber 84%, p < 0,001, Abbildung 3c), wie durch das Überleben des Empfängers 12 Wochen nach der Transplantation bestimmt. Darüber hinaus hat die Anwendung dieses modifizierten Transplantationsverfahrens keinen Einfluss auf die Nierenallotransplantatfunktion, wie sie durch Serumkreatinin während des Beobachtungszeitraums von12 Wochen 10 beurteilt wurde.
| Konventionell | Neue knotenlose Technik | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Betriebszeiten | ||
| Zeit für arterielle Anastomose (min) | 9,2 ± 0,09 | 7,5 ± 0,06** |
| Zeit für venöse Anastomose (min) | 9,1 ± 0,10 | 7,5 ± 0,05** |
| Komplikationsraten | ||
| Thrombose | 8 (6.6%) | 2 (1,1%)* |
| Lokale Blutungen | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Erfolgsquote | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. Eine knotenlose Technik zur Nierentransplantation in der Maus. J Transplantation. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabelle 1: Vergleich dieser neuen Technik (n = 175) mit der konventionellen Technik (n =122) in Bezug auf technische Aspekte des Verfahrens und intraoperative und postoperative Komplikationen 10. Zahlen stellen die Betriebszeiten in Minuten jedes Vorgangs dar (Mittelwert ± SD).
Abbildung 1: Repräsentative histologische Ergebnisse zur Beurteilung der tubulären Atrophie. HE Färbung von Nierentransplantationen 4 Wochen nach der Transplantation (40x): (a) normale nicht transplantierte Niere, (b) konventionelle Technik und (c) modifizierte Technik einer syngenen Nierentransplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative histologische Ergebnisse zur Beurteilung der interstitiellen Fibrose. Masson Goldners trichrome Färbung 12 Wochen nach der Transplantation (40x) von (a) normaler nicht transplantierter Niere, (b) konventioneller Technik und (c) modifizierter Technik einer syngenen Nierentransplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich der Betriebszeiten von Gefäßanastomosen, der Häufigkeit von Komplikationen und der Erfolgsraten zwischen der modifizierten und der konventionellen Technik10 Die Balkendiagramme in (a) zeigen die für die Durchführung der Gefäßanastomose erforderliche Betriebszeit; die Balkendiagramme in (b) Intratransplantatthromboseereignisse und lokale Blutungsprobleme darstellen; während die Bargraphen in (c) eine höhere Erfolgsrate der neuen knotenlosen Technik entsprechend dem Überleben größer als 12 Wochen nach der Transplantation nach zusätzlicher Explantation der nativen kontralateralen Niere zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Überblick über die anatomische Struktur (obere Paneele a und b) und Resektionslinien der Aorta und Nierenarterie sowohl für die konventionelle (c) als auch für die modifizierte Technik (d ). (A) Abdominaria, (B) Nierenarterie, (C) Harnleiterarterie, (D) Niere, (E) Harnleiter. Die venösen Gefäße (V. cava, einschließlich der Vv. renales) werden als gepunktete Linien dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispielhafte Demonstration einer knotenlosen Vernähung der Arteriengefäßanastomose mit (A) der Bauchaorta, (B) der Nierenarterie und (C) der knotenlosen Nähtechnik, bei der der letzte Stich der Anastomose nicht gebunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Anastomose des Spenderharnleiters mit der Urinblase des Empfängers. (a) mit einem 10/0-Monofilament durch die Harnblase des Empfängers eindringen und in das Lumen einer 21-G-Nadel einführen, (b) die 21-G-Nadel führen, um ein Loch durchzuführen, das sich an der vorherigen Nadelperforation befindet, (c) die 21-G-Nadel herausziehen, (d) das beschnittene Harnleiterende mit der 10/0-Naht vernähen und die Blase mit der 10/0-Naht an der Eintrittsstelle erneut perforieren, (e) schleppen Sie dann die 10/0-Naht und den Harnleiter durch das konstruierte Loch in die Urinblase, (f) und anastomosieren Sie den Harnleiter des Spenders mit einer weiteren 10/0-Naht zur Blase des Empfängers. Ziehen Sie schließlich die Zugnaht heraus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Während das Hauttransplantationsmodell bei Mäusen einfach und leicht durchzuführen ist, um alloimmune Abstoßungsereignisse zu untersuchen, haben sich die chirurgischen Techniken zur Untersuchung der alloimmunbedingten entzündlichen Veränderungen nach Herz16 und Nierentransplantation10 als komplex und sehr anspruchsvoll erwiesen. Aus Sicht des Transplantationnephrologen hat die Etablierung eines effektiven und langzeitstabilen Mausnierentransplantationsmodells für viele funktionelle und immunologische Studien noch eine unersetzliche Bedeutung. Darüber hinaus kann das Nierentransplantationsmodell der Maus im Vergleich zu anderen Organtransplantationen ein langfristiges Überleben erreichen, selbst mit bestimmten Unterschieden in den wichtigsten Histokompatibilitätsantigenen, was die Möglichkeit bietet, Immunregulationsmechanismen bei der langfristigen Entwicklung sowohl der Abstoßung als auch der Identifizierung von Voraussetzungsfaktoren zur Etablierung der Alloimmuntoleranzzu untersuchen 3.
Wie bereits beschrieben, ist die Nierentransplantation bei Mäusen ein herausforderndes Verfahren, und die Erfolgsraten selbst erfahrener Chirurgen variieren stark zwischen 40 und 95%10,17,18,19,20. In Bezug auf die Berichte verschiedener Forschungsteams auf der ganzen Welt über diese Operationstechnik haben wir die folgenden Änderungen im Vergleich zum klassischen Ansatz vorgenommen, die zu mehreren Verbesserungen geführt haben.
Zuerst wird ein Fleck der Bauchaorta geschnitten und vorbereitet, so dass die proximalen Bifurkationen der Nierenarterie und der Harnleiterarterie durchblutet werden, einschließlich der Spenderniere en bloc. Dieses Manöver erhält und erhält nicht nur die Blutversorgung und Funktion des Harnleiters des Spenders vollständig aufrecht, indem es eine Verletzung des periureteralen Gewebes vermeidet und so eine postoperative Hydronephrose verhindert, sondern es verhindert auch postoperative Einschränkungen der Nierenarterie (Abbildung 4). Daher wird eine Nierentransplantationsischämie, die durch eine Striktur der Nierenarterie vermittelt oder durch eine Hydronephrose verursacht wird, die durch einen verengten und ischämischen Transplantationsharnleiter vermittelt wird, vermieden, was zwei der Schlüsselaspekte darstellt, um das langfristige Überleben der Transplantation in diesem Modell zu erreichen. Es gibt jedoch anatomische Varianten für die Nachkommen der Harnleiterarterie. Zum Beispiel stammt bei einigen Mäusen die Harnleiterarterie aus dem Hauptstamm der Bauchaorta und nicht aus der Nierenarterie und die Position dieser Nachkommen ist meist etwa 0,2 bis 0,5 mm distal von den Nachkommen der Nierenarterie (dargestellt in Abbildung 4). Aus unserer Erfahrung würden wir das Auftreten der Harnleiterarterie, die direkt von der Aorta ausgeht, bei etwa 20% der männlichen C57BL/6J-Mäuse (unveröffentlichte Beobachtung) und seltener bei anderen Mäusestämmen wie BALBc schätzen. In einigen der berichteten traditionellen chirurgischen Methoden wurde dieses wichtige Nährstoffgefäß manchmal vernachlässigt, da es missachtet und direkt ligiert oder elektrokauterisiert wurde.
Besonders in diesen Situationen anatomischer Varianten, in denen der Nachwuchs der Harnleiterarterie der Maus aus dem Hauptstamm der Bauchaorta unterhalb der Nachkommen der Nierenarterie stammt, ist diese Methode der En-bloc-Transsektion und Rekonstruktion der Aortenanastomose noch besser geeignet. Erfahrene Chirurgen können sogar entscheiden, wann sie die traditionelle oder modifizierte en-bloc-Anastomose verwenden.
Zweitens bietet die Anwendung einer neuen, einfachen und schnellen Technik einer knotenlosen vaskulären Anastomose, bei der der letzte Stich der Anastomose nicht wie der traditionelle Ansatz mit dem Ende des oberen Bandes verbunden ist, sondern stattdessen frei bleibt, einen wertvollen Vorteil (siehe Abbildung 5). Diese Technik ermöglicht es immer noch, die Größe der Anastomose zu erhöhen oder zu verringern, nachdem die Reperfusion der Nierentransplantation bereits eingeleitet wurde. Dies vermeidet die Entwicklung von Gefäßverengungen und intraabdominalen Blutungen. Darüber hinaus können die freien Schwänze der Verankerungsstiche an beiden Enden in entgegengesetzte Richtungen gezogen werden, um die Anastomose flexibel anzupassen und zu erweitern, um eine Stenose der Arterien oder Venen zu vermeiden. Die Nähtechnik verbessert daher die Fehlertoleranzrate der Operation und ist anfängerfreundlich20.
Drittens, um die Anastomose des Spenderharnleiters und der Empfängerblase atraumatisch durchzuführen, wurden 21 G und 30 G Spritzennadeln als zusätzliche Einstichführungswerkzeuge verwendet. Bei Mäusen ist der Harnleiter ziemlich dünn und sehr empfindlich, um eine End-to-End-Anastomose durchzuführen. Normalerweise wird der Spenderharnleiter direkt mit einer Pinzette in die Blase gezogen, um den Harnleiter nach dem Perforieren der Blase mit einer Spritzennadel zu führen. Wir haben diese Methode weiter verbessert, indem wir eine Spritzennadel mit einem dünneren Durchmesser von 30 G als Leitfaden für die 21 G Spritzennadel (Seldinger-Verfahren) verwendet haben. Bei dieser atraumatischen Technik dringt die 21 G Spritzennadel nicht in die gesamte Blase ein, was die Schädigung der Blase und die Schwierigkeit der Harnleiterimplantationreduziert 17 (Ergänzende Abbildung 1).
Ein kritischer Schritt des Protokolls ist die Konfiguration der arteriellen Öffnung. In beiden Fällen (Spender und Empfänger) müssen diese ordentlich geschnitten werden, da sonst die Qualität der Anastomose beeinträchtigt wird. Darüber hinaus ist bei dieser neuen knotenlosen Technik der letzte Stich nicht an den geknoteten Faden gebunden. Nach der Anastomose sollte der Chirurg das anastomitische Stoma zunächst klein halten. Ziehen Sie dann nach der Reperfusion die Enden des Fadens am oberen und unteren Ende, um ihn zu vergrößern. Ein weiterer kritischer Schritt, den man beachten muss, ist die Positionierung des Schnitts der Spendernierenarterie, da die Harnleiterarterie identifiziert werden muss, um geschützt zu werden.
Eine wesentliche Einschränkung dieser Technik ist - neben den beschriebenen Verbesserungen -, dass der Bediener immer noch hohe Anforderungen erfüllen muss, da die Schiffswände klein und sehr zart sind. Ohne intensives und beharrliches Üben wird die Erfolgsquote der Operation niedrig sein.
Zusammenfassend zeigt dieser Bericht die Anwendbarkeit einer technischen Modifikation des Nierentransplantationsverfahrens bei Mäusen. Das hier vorgestellte chirurgische Verfahren hat sich als wertvolle und zuverlässige Methode erwiesen, die in den letzten 10 Jahren als wesentlicher Bestandteil mehrerer Forschungspublikationen diente 3,19,20. Im Vergleich zum klassischen und weit verbreiteten Operationsmodell liefert die hier demonstrierte Methode mehrere wichtige Verbesserungen, die zu weniger Komplikationsraten und einer längeren Transplantationsüberlebensrate im syngenen Nierentransplantationssettingführen 3. Es ist wichtig zu erwähnen, dass beide Techniken (modifizierte und konventionelle) die gleichen weiteren Komplikationen aufweisen, die sich auf die Sterblichkeit des Empfängers auswirken, wie z. B. Tod durch viszerale Schäden, Austreten von Urin, Hydronephrose, Infektionen usw., die sich nicht unterschieden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese neue Operationstechnik die Gesamterfolgsrate und das langfristige Überleben des Transplantats verbessert und damit ein zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung der Alloimmunantwort nach einer Nierentransplantation darstellt.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Tiantian Bai Team für die Hilfe bei der Sprachausgabe, Miss Mian Pao für ihre Hilfe bei der medizinischen Illustration. Diese Arbeit wurde unter anderem von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zur Förderung internationaler Kooperationen (HO2581/4-1 to AH) und der National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 bis FJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
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