Summary
Detta protokoll presenterar en ny kirurgisk teknik för njurtransplantation hos möss med fokus på en modifierad arteriell anastomosstrategi. En vaskulär suturteknik inklusive en enkel och säkrare urinledar-urinblåsans anastomosmetod presenteras också. Dessa modifieringar förkortar operationstiden och förbättrar framgångsgraden för musnjurtransplantationsproceduren.
Abstract
Njurtransplantation hos möss är ett komplicerat och utmanande kirurgiskt ingrepp. Det finns väldigt få publikationer som visar de viktigaste stegen i denna operation. Därför introducerar denna artikel tekniken och påpekar de kirurgiska försiktighetsåtgärderna i samband med denna operation. Dessutom demonstreras viktiga modifieringar jämfört med det konventionella förfarandet. För det första skärs och bereds en lapp av bukaorta så att de proximala bifurkationerna i njurartären, inklusive urinartären, transekteras tillsammans med donatornjuren en bloc. Detta minskar risken för urinledarnekros och undviker utveckling av urinvägsocklusion. För det andra demonstreras en ny metod för vaskulär anastomos som gör det möjligt för operatören att flexibelt öka eller minska storleken på anastomosen efter att njurtransplantationsreperfusion redan har initierats. Detta undviker utveckling av kärlförträngningar och intraabdominal blödning. För det tredje visas en teknik som möjliggör anastomos hos den känsliga donator urinledaren och mottagarblåsan som inte orsakar ett trauma. Att anta detta protokoll kan förkorta operationstiden och minska skadorna på mottagarens urinblåsa, vilket avsevärt ökar operationsframgångsgraden för mottagarmössen.
Introduction
utvecklade musmodeller för njurtransplantation 1973 för första gången1, det har visat sig vara ett viktigt experimentellt verktyg för att studera mekanismerna för transplantation ischemisk skada och alloimmune avstötning samt för att utveckla nya behandlingar som syftar till att förlänga allograft överlevnad och eventuellt för att uppnå immunologisk tolerans. Den kirurgiska tekniken har emellertid visat sig vara komplex och mycket krävande, ibland med komplikationer som vaskulär anastomotisk striktur som leder till prerenal icke-immunologisk njurtransplantationssvikt2, postrenalt misslyckande orsakat av ischemi och efterföljande nekros hos den transplanterade urinledaren, strikturer av anastomosen hos den transplanterade urinledaren och / eller mottagarens urinblåsa som leder till en störning av urinutflödet. Allt detta är anledningar till att njurtransplantation hos möss inte har vidareutvecklats och därför inte används i stor utsträckning. Att etablera en effektiv och långsiktig stabil mus njurtransplantationsmodell utan kärl- och urinvägskomplikationer har fortfarande oersättlig betydelse för många studier inom transplantationsområdet med fokus på njurimmunmedierade men även infektionssjukdomar3. Dessutom, jämfört med andra organtransplantationer i murina modeller som lung-, hjärt- och tarmtransplantation 4,5, erbjuder musnjurtransplantationsmodellen en chans att studera långsiktig överlevnad även i inställningen av större histokompatibilitetsantigenskillnad 3,6. Det har också visat sig att i samma miljö av givar-mottagarstamkombinationer kännetecknas olika organtransplantationer som hjärta eller njure av olika dynamik och början av allograftavstötning3. Ur nefrologisk synvinkel är det dessutom en mer lämplig modell för att studera parenkymala medierade immunregleringsmekanismer i samband med akuta och kroniska avstötningshändelser än enkla hudtransplantationsexperiment.
På grundval av tidigare rapporter om den kirurgiska tekniken för njurtransplantation hos möss 3,7,8,9 visar vi här följande tillförlitliga förbättringar som framgångsrikt har tillämpats under de senaste 10 åren inom vår grupp 10,11,12: För det första bevaras urinartären säkert när njurartären resekteras en bloc tillsammans med respektive del av bukaortan. För det andra, en ny, enkel och snabb teknik för en knutlös vaskulär anastomos där den sista sömmen av anastomos inte är bunden med slutet av den övre slipsen som det traditionella tillvägagångssättet utan förblir fri. Denna teknik gör det möjligt att öka eller minska storleken på anastomosen efter njurreperfusion för att undvika kärlförträngning och intraabdominal blödning. För det tredje användes 21 G och 30 G sprutnålar som ett extra punkteringsstyrningsverktyg för att implantera donatorurledaren i mottagarens blåsvägg, vilket minskade skadorna på mottagarens urinblåsa och underlättade bildandet av strikturfri anastomos.
I denna rapport jämförde vi också den traditionella, allmänt använda tekniken med den modifierade som är etablerad i vårt laboratorium och fann ingen signifikant skillnad i graden av renal tubulär atrofi och njurtransplantation interstitiell vävnadsfibros. I tidigare studier jämförde vi dessutom resultaten av denna nya teknik med den konventionella metoden när det gäller lokal blödning, trombos, tid för att utföra kärlanastomos och överlevnad. Vi fann förbättringar som signifikanta minskningar av lokala tromboshändelser (1,1% mot 6,6%), en minskad tid för anastomosproceduren och en mycket reproducerbar njursyngeneisk transplantat långsiktig överlevnad (95% mot 84% med det klassiska tillvägagångssättet)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna från Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (Djuretiskt kort: Niedersachsens ministerium för livsmedels- och läkemedelssäkerhet, #33.9-42502-04-11/0492). Utför procedurer med sterila kirurgiska instrument och förbrukningsvaror (autoklaverade) och försök att hålla operationsområdet så sterilt som möjligt.
OBS: C57BL /6J hanmöss fungerade som givare och mottagare (syngeneisk transplantationsmodell) medan Balb / c-möss fungerade som njura allograftmottagare (modell för att studera akut allograftavstötningsmodell9). Mössen var i åldern mellan 8-12 veckor, vägde ~25-30 g vid transplantation och inhystes under standardförhållanden. Data som rapporterades i detta manuskript genererades av fyra kirurger med erfarenhet av mösskirurgi.
1. Förberedande steg
- För kirurgi, använd en uppsättning mikroskopiska instrument, inklusive en mikrosax, mikrotång, en nålhållare, mikrohemostatiska klämmor och en elektrokirurgisk penna. Utför suturer med 7/0er, 10/0er eller 4/0er nylonmonofilament.
- För anestesi, placera musen i lådan för inandning av isofluran (2%) i ca 40-60 s för att inducera medvetslöshet.
- När musen är sövd väger du musen.
- Beroende på musens vikt, applicera en intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg) för att bedöva musen13. Bekräfta att musen är sövd genom att observera brist på svar på en tånypa.
- När anestesi har trätt i kraft, klipp bukpälsen. Fäst sedan musen på operationsbordet genom att löst immobilisera lemmarna med ett sterilt maskeringstejp.
- Desinficera musens buk efter att ha placerat musen på operationsbordet. Utför desinfektion med alternerande skrubba av povidonjodid (jodfor) och alkohol, tre gånger (använd koncentriskt mönster, börja skrubba i mitten av buken och rör dig utåt) och drapera sedan musen ordentligt med en fenestraterad kirurgisk handduk.
- Applicera ögonsalva och behåll sterilitet under hela proceduren.
OBS: Antibiotika rekommenderas inte under hela proceduren eftersom dessa ämnen kan påverka immunologiska svar.
2. Förfarande för operation av givare
- Använd sax för att skära huden och utför ett korsning av buken på cirka 3-4 cm. Skär musklerna i bukväggen. Täck och försiktigt flytta bort inälvorna med en saltlösning imbibed gasbindning.
- Använd en bomullspinne för att försiktigt ta bort tarmarna, magen och mjälten mot höger sida (ur musens synvinkel), täck och flytta försiktigt bort inälvorna med en saltlösning imbibed gasväv.
- Använd mikrotång för att exponera vänster njure, aorta och sämre vena cava (IVC).
- Använd en elektrokirurgisk penna för att cauterize de vänstra ländryggsvenerna, inklusive deras underliggande grenar och andra små kärl tillsammans med vänster binjurekärl, försiktigt.
- Använd mikrosax och pincett för att dissekera vänster urinledare och försiktigt mobilisera den från den omgivande vävnaden. Rengör skär den nära urinblåsan. Mobilisera aortaområdet mellan vänster och höger njurartärer ca 2 mm i längd.
- Använd mikrotång för att separera den infraröda underlägsna vena cava (IVC) och aortan, och använd sedan böjda tångar för att passera under aortan för att placera en lös slips av 7-0 silkesutur runt detta kärl.
- Korsklämma området av aortan under den högra njurartären och den underlägsna vena cava (IVC) med två 5 mm mikrovaskulära klämmor.
- Transekt den vänstra njurvenen från vena cava.
- Använd en spruta för att spola aortan med 1 ml heparin saltlösning (60 U/ml).
- Använd mikrotång för att dra åt ligaturen som appliceras i steg 2.5. Skär sedan aortan under ligaturen såväl som under den proximala klämman. Med detta ingår de proximala bifurkationerna i njurartären (observera att artäröppningen måste skäras snyggt, annars kommer det att påverka anastomosen) och urinartären ingår och transekteras en block. Förbered dig noggrant så att den känsliga ureterala artären är helt bevarad.
- Använd den elektrokirurgiska pennan och pincetten för att frigöra vänster njure och tillhörande kärl helt genom att försiktigt cauterisera allt kärl som omger vävnad. Ta bort njuren och förvara den i saltlösning vid 4 °C.
- Avliva den sövda donatormusen genom halshuggning.
3. Förfarande för mottagarens åtgärd
- Utför de första kirurgiska stegen (inklusive anestesi och sterilisering, se steg 1.1 till 1.7) enligt beskrivningen för donatormusen.
- Använd sax för att öppna buken via ett mediansnitt (cirka 2,5 cm långt) och täck sedan bukorganen med en våt gasväv med saltlösning.
- Bevara försiktigt den infraröda aortan och underlägsna vena cava (IVC) och se till att varje stor kärlgren är cauterized. Använd också den elektriska cautery för att dissekera den vänstra urinledaren försiktigt i ett läge som är proximalt mot njurbäckenet. Ta sedan bort den vänstra njuren.
- Använd mikrotång och bomullspinnar för att exponera bukaorta och underlägsen vena cava och lossa dem från den omgivande fettvävnaden (ungefär över 4 mm lång).
- Använd två mikrovaskulära klämmor och placera dem proximalt och distalt på både den underlägsna vena cava och bukaorta samtidigt.
- Använd en mikronålhållare för att styra en 10/0 monofilament (gjord av syntetfiber med en slät yta) suturnål, som placeras genom aortaväggen på ett proximalt till distalt sätt.
- Uppnå en elliptisk arteriotomi på cirka 1 mm med en mild uppåtgående dragkraft av suturen, medan du skär direkt under nålens nedre yta med fin, krökt sax.
- Använd mikrosax för att klippa den underlägsna vena cava (IVC) i längdriktningen med tillräcklig längd på cirka 1,5 mm. Placera detta snitt något under dess aorta motsvarighet.
- Utför givarens och mottagarens aorta-anastomos på ett end-to-side-sätt. Placera donatornjuren på höger sida av mottagarens underlägsna vena cava och anpassa manschetten på donatorns bukaorta med anastomosen hos mottagarens bukaorta.
- Använd en mikronålhållare och två separata 10-0 suturer för att sy de proximala och distala ändarna av anastomosen.
- Efter bindning, lämna de två långa suturerna, inklusive nålen, på plats. Sy den vänstra sidan av anastomosens aortavägg kontinuerligt med två jämnt fördelade stygn i en distal-proximal riktning.
- Efter den sista sömmen, styr suturen genom en deltjocklek på kärlväggen ovanför den övre suturbindningen.
- Använd mikrotång för att samtidigt utöva mild dragkraft till den korta änden av den nedre suturbindningen.
OBS: I denna nya knutlösa teknik är den sista sömmen inte knuten till den korta änden av den övre slipsen. - Använd mikrotång för att vända den transplanterade njuren till sitt normala läge. Sy nu kontinuerligt den högra väggen i aortanastomosen med tre stygn på ett proximalt till distalt sätt.
OBS: Jämfört med den konventionella kirurgiska tekniken 7,8 slås den sista suturen samman med den distala slipsen i närheten. Bind den inte till slutet av den nedre suturen, skär den för att lämna en fri längd på 2-3 mm istället. - Utför venös anastomos med samma sutureringsförfarande som tidigare beskrivits med skillnaden att fyra till fem stygn behövs för varje sida av anastomosen. Den slutliga sömmen lämnas som en fri ände av liknande längd som liknar den aortalanastomos som beskrivs ovan.
- Efter att ha slutfört båda anastomoserna, använd en torr vattpinne för att utöva försiktigt tryck mot det suturerade området i cirka 10-20 s.
- Använd en klämapplikatortång för att ta bort båda klämmorna, först den nedre sedan den övre. Skölj bukhålan med 0,9% natriumklorid vid en temperatur av 38,0 °C.
- Observera reperfusionen av den transplanterade njuren.
4. Ureteral implantation
- Använd en mikronålshållare för att tränga igenom mottagarens urinblåsa med en 10/0 sutur (rak nål) och sätt in den i en 21 G nållumen för vägledning (se kompletterande figur 1a).
- Styr nu 21 G-nålen för att sy ett hål på platsen för den tidigare nålapplikationen (kompletterande figur 1b).
- Dra ut 21 G-nålen (kompletterande figur 1c).
- Använd en mikronålhållare och 10/0 sutur för att sy (ingen slips) den trimmade urinledaren och perforera urinblåsan med denna 10/0 sutur igen på platsen för dess inträde (kompletterande figur 1d).
- Använd en mikronålshållare för att dra in 10/0-glödtråden och urinledaren i urinblåsan genom det konstruerade hålet (kompletterande figur 1e).
- Använd en mikronålhållare och en annan 10/0 sutur för att anastomosera donatorns urinledare till mottagarens urinblåsa. Anslut här urinledarens yttre membran till blåsväggens yttre membran och utför intermittenta suturer med 3 till 4 stygn. Dra slutligen ut dragsuturen (kompletterande figur 1f).
- Använd pincett för att placera tarmarna tillbaka i bukhålan. Utför tvåskiktssuturer (först magmusklerna följt av huden) för att stänga buksåret med en 4/0 filament.
- Placera de transplanterade mössen i en syre- och temperaturkontrollerad kammare för återhämtning efter operationen.
- För postoperativ analgesi, ge Metamizol direkt 200 mg/kg per os efter operationen.
Fyra och 16 h efter operation ger Metamizol 200 mg/kg per os plus Carprofen (5 mg/kg) s.c. I den fortsatta uppföljningen, applicera Carprofen (5 mg/kg) s.c. på de transplanterade mössen var 24:e timme under tre på varandra följande dagar efter operation13. Om det finns tecken på otillräcklig analgesi ges buprenorfin 0,05 mg/kg dessutom var 8:e timme s.c.
5. Kontralateral nefrektomi och offer av mottagarmusen
OBS: Utför kontralateral nefrektomi av mottagarmusen 5 dagar efter transplantation.
- Utför den kontralaterala nefrektomin hos den transplanterade musen 5 dagar efter transplantation under anestesi. Ligate och skär mottagarens autologa högra njurartärer och vener, ta bort höger njure och stäng bukhålan. Den postoperativa vården och smärtlindringen är desamma som beskrivits tidigare (se steg 4.7).
- Höj och spela in musens tillstånd. Ge den transplanterade musen postoperativ analgesi, mat och vattenförsörjning.
- Fyra veckor efter transplantationen, offra hälften av de transplanterade mössen och utför H&E-färgning för deras njurtransplantationer.
- 12 veckor efter transplantation, offra de återstående mössen och utför Masson Gold-färgning av dessa njurtransplantationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fyra veckor efter transplantationen visade både den modifierade tekniken och den konventionella tekniken måttliga tecken på renal tubulär atrofi14,15 jämfört med de infödda mottagarens kontralaterala njurar (figur 1). Graden av renal tubules atrofi visade ingen signifikant skillnad mellan de två olika teknikerna. Masson Goldners trikromfärgning14,15 av njurarna 12 veckor efter transplantation visade enhetligt tydliga tecken på interstitiell vävnadsfibros jämfört med normala icke-transplanterade njurar (figur 2).
Vi har tidigare undersökt utfallet av denna nya knutlösa teknik (n = 175) och jämfört den med det klassiska tillvägagångssättet (n = 122) när det gäller tekniska aspekter av proceduren och intraoperativa och postoperativa komplikationer (se även tabell 1)10. Den modifierade tekniken som visas här var associerad med en lägre förekomst av intragraft arteriella eller venösa trombotiska händelser (figur 3b, 1,1% mot 6,6%). Tiden för att utföra anastomosen var signifikant mindre (figur 3a), och en mycket reproducerbar långtidsöverlevnad av njurtransplantat uppnåddes (95% mot 84%, p < 0,001, figur 3c) som bestämdes av mottagarens överlevnad 12 veckor efter transplantationen. Dessutom påverkar tillämpningen av detta modifierade transplantationsförfarande inte njurallograftfunktionen som bedöms med serumkreatinin under observationsperioden på 12 veckor10.
| Konventionell | Ny knutlös teknik | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Öppettider | ||
| Tid för arteriell anastomos (min) | 9,2 ± 0,09 | 7,5 ± 0,06** |
| Tid för venös anastomos (min) | 9.1 ± 0.10 | 7,5 ± 0,05** |
| Komplikationsfrekvens | ||
| Trombos | 8 (6.6%) | 2 (1,1 %)* |
| Lokal blödning | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Framgång | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. En knutlös teknik för njurtransplantation i musen. J Transplantation. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabell 1: Jämförelse av denna nya teknik (n = 175) med den konventionella tekniken (n = 122) när det gäller tekniska aspekter av proceduren och intraoperativa och postoperativa komplikationer10. Siffror representerar driftstiderna i minuter för varje procedur (medelvärde ± SD).
Figur 1: Representativa histologiska resultat som bedömer tubulär atrofi. HE Färgning av njurtransplantationer 4 veckor efter transplantation (40x): (a) normal icke-transplanterad njure, (b) konventionell teknik och (c) modifierad teknik för en syngeneisk njurtransplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa histologiska resultat som bedömer interstitiell fibros. Masson Goldners trikromfärgning 12 veckor efter transplantation (40x) av (a) normal icke-transplanterad njure, (b) konventionell teknik och (c) modifierad teknik för en syngeneisk njurtransplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av drifttider för kärlanastomoser, frekvens av komplikationer och framgångsgrader mellan den modifierade och den konventionella tekniken10 Bargraferna i (a) visar den driftstid som krävs för att utföra kärlets anastomos; bargraferna i (b) visar intragraft tromboshändelser och lokala blödningsproblem; medan bargraferna i (c) visar en högre framgångsgrad för den nya knutlösa tekniken enligt överlevnaden större än 12 veckor eftertransplantation efter ytterligare explantation av den inhemska kontralaterala njuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Översikt över den anatomiska strukturen (övre panelerna a och b) och resektionslinjerna i aortan och njurartären för både den konventionella (c) och den modifierade tekniken (d). (A) Abdominal aorta, (B) Njurartär, (C) Ureteral artär, (D) Njure, (E) Urinledare. De venösa kärlen (V. cava, inklusive Vv. renales) avbildas som prickade linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exemplifierande demonstration av en knutlös sömnad av artärkärlets anastomos som visar (A) bukaorta, (B) njurartären och (C) den knutlösa sömnadstekniken där den sista sömmen av anastomosen inte är bunden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Anastomos hos donatorns urinledare med mottagarens urinblåsa. (a) Tränga igenom mottagarens urinblåsa med en 10/0 monofilament och sätt in den i en 21 G nåls lumen, (b) Styr 21 G-nålen för att utföra ett hål som ligger vid föregående nålperforering, (c) dra ut 21 G-nålen, (d) sy den trimmade urinledarens ände med 10/0 suturen och perforera blåsan med 10/0 suturen igen på platsen för dess inträde, e) sedan dra in suturen 10/0 och urinledaren i urinblåsan genom det konstruerade hålet, f) och anastomosera donatorns urinledare till mottagarens urinblåsa med ytterligare en 10/0 sutur. Dra slutligen ut dragsuturen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan hudtransplantationsmodellen hos möss är enkel och lätt att utföra för att studera alloimmune avstötningshändelser, har de kirurgiska teknikerna för att undersöka mer specifikt de alloimmune-relaterade inflammatoriska förändringarna efter hjärta16 och njurtransplantation10 visat sig vara komplexa och mycket krävande. Ur transplantationsnefrologens synvinkel har upprättandet av en effektiv och långsiktig stabil mus njurtransplantationsmodell fortfarande en oersättlig betydelse för många funktionella och immunologiska studier. Dessutom, jämfört med andra organtransplantationer, kan musnjurtransplantationsmodellen uppnå en långsiktig överlevnad även med vissa skillnader i stora histokompatibilitetsantigener, vilket innebär möjlighet att studera immunregleringsmekanismer i den långsiktiga utvecklingen av både avstötning eller identifiering av förutsättningsfaktorer för att fastställa alloimmune tolerans3.
Som beskrivits tidigare är njurtransplantation hos möss ett utmanande förfarande, och framgångsgraden för även erfarna kirurger varierar mycket mellan 40 och 95% 10,17,18,19,20. När det gäller rapporterna från olika forskargrupper runt om i världen om denna kirurgiska teknik har vi gjort följande modifieringar jämfört med det klassiska tillvägagångssättet som leder till flera förbättringar.
Först skärs en lapp av bukaorta och bereds så att de proximala bifurkationerna i njurartären och urinartären transekteras, inklusive donatornjuren en bloc. Denna manöver bevarar och behåller inte bara blodtillförseln och funktionen hos givarens urinledare genom att undvika en skada på periureteralvävnaden, vilket förhindrar en postoperativ hydronephrosis, men det förhindrar också postoperativa strikturer i njurartären (Figur 4). Därför undviks njurtransplantationsischemi medierad av en striktur av njurartären eller orsakad av en hydronephrosis medierad av en strikturerad och ischemisk transplantations urinledare, vilket representerar två av de viktigaste aspekterna för att uppnå långsiktig transplantationsöverlevnad i denna modell. Det finns emellertid anatomiska varianter för avkomman i ureteralartären. Till exempel, hos vissa möss härstammar ureteralartären från bukaortans huvudstam istället från njurartären och positionen för denna avkomma är mestadels cirka 0,2 till 0,5 mm distal från njurartärens avkomma (avbildad i figur 4). Från vår erfarenhet skulle vi uppskatta förekomsten av ureteral artär som härrör direkt från aortan hos cirka 20% av C57BL / 6J hanmöss (opublicerad observation), och mer sällan i andra stammar av möss som BALBc. I några av de rapporterade traditionella kirurgiska metoderna försummades detta viktiga näringskärl ibland att skydda, eftersom det ignorerades och direkt ligerades eller elektrokauterades.
Speciellt i dessa situationer av anatomiska varianter när avkomman till musens ureterala artär härrör från bukaortans huvudstam under njurartärens avkomma, är denna metod för blocktranssektion och rekonstruktion av aorta-anastomosen ännu mer lämplig. Erfarna kirurger kan till och med bestämma när de ska använda den traditionella eller modifierade en bloc anastomosen.
För det andra erbjuder tillämpningen av en ny, enkel och snabb teknik för en knutlös vaskulär anastomos där den slutliga sömmen av anastomos inte är bunden med slutet av den övre slipsen som det traditionella tillvägagångssättet utan förblir fri istället en värdefull fördel (se figur 5). Denna teknik tillåter fortfarande att öka eller minska storleken på anastomosen efter njurtransplantation reperfusion har redan initierats. Detta undviker utveckling av kärlförträngningar och intraabdominal blödning. Dessutom kan de fria svansarna på förankringsstygnen i båda ändarna dras i motsatta riktningar för att flexibelt justera och expandera anastomosen för att undvika stenos i artärerna eller venerna. Sömnadstekniken förbättrar därför kirurgifeltoleransen och är vänlig för nybörjare20.
För det tredje, för att atraumatiskt utföra anastomosen hos donator urinledaren och mottagarblåsan, användes 21 G och 30 G sprutnålar som extra punkteringsstyrningsverktyg. Hos möss är urinledaren ganska tunn och mycket känslig för att utföra en end-to-end anastomos. Vanligtvis dras donator urinledaren direkt in i urinblåsan med hjälp av pincett för att styra urinledaren efter perforering av urinblåsan med en sprutnål. Vi har ytterligare förbättrat denna metod genom att använda en 30 G sprutnål med tunnare diameter som vägledning för 21 G sprutnål (Seldinger-proceduren). Med denna atraumatiska teknik tränger 21 G sprutnålen inte in i hela blåsan, vilket minskar skadorna på blåsan och svårigheten med ureteralimplantationen17 (kompletterande figur 1).
Ett kritiskt steg i protokollet är konfigurationen av artäröppningen. I båda fallen (givare och mottagare) måste dessa skäras snyggt, annars kommer det att påverka kvaliteten på anastomosen. Dessutom, i denna nya knutlösa teknik, är den sista sömmen inte knuten till den knutna tråden. Efter anastomos bör kirurgen initialt hålla den anastomatiska stomin liten. Sedan, efter reperfusion, dra trådens ändar i de övre och nedre ändarna för att förstora den. Ett annat kritiskt steg som man måste vara medveten om är placeringen av snittet av donatorns njurartär eftersom urinledartären måste identifieras för att skyddas.
En stor begränsning med denna teknik är - förutom de beskrivna förbättringarna - att operatören fortfarande behöver uppfylla höga krav eftersom fartygsväggarna är små och mycket ömma. Utan intensiv och uthållig övning kommer operationens framgångsgrad att vara låg.
Sammanfattningsvis visar denna rapport tillämpligheten av en teknisk modifiering av njurtransplantationsförfarandet hos möss. Det kirurgiska förfarandet som presenteras här har visat sig vara en värdefull och pålitlig metod som fungerade som en viktig del av flera forskningspublikationer under de senaste 10 åren 3,19,20. I jämförelse med den klassiska och allmänt etablerade kirurgimodellen ger metoden som demonstreras här flera viktiga förbättringar som leder till mindre komplikationsfrekvens och en längre transplantationsöverlevnad i den syngena njurtransplantationsinställningen3. Det är viktigt att nämna att båda teknikerna (modifierade och konventionella) delar samma ytterligare komplikationer som påverkar mottagarens dödlighet, såsom dödsfall genom visceral skada, urinläckage, hydronephrosis, infektioner etc., som inte skilde sig åt. Sammanfattningsvis förbättrar denna nya kirurgiska teknik den totala framgångsgraden och den långsiktiga transplantatöverlevnaden vilket gör den till ett pålitligt verktyg för att studera alloimmune-svaret efter njurtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Tiantian Bai-teamet för hjälp med voice over, Miss Mian Pao för hennes hjälp med medicinsk illustration. Detta arbete stöddes delvis av den tyska forskningsstiftelsen (DFG) för att främja internationella samarbeten (HO2581/4-1 till AH) och National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 till FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
